鳥(niǎo)氨酸脫羧酶基因作為胃癌診治靶標(biāo)可行性的研究.pdf

1、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）為多胺合成第一個(gè)限速酶，催化鳥(niǎo)氨酸脫羧生成腐胺，腐胺再相繼生成精脒和精胺。腐胺、精脒和精胺統(tǒng)稱(chēng)多胺。多胺的代謝與腫瘤的發(fā)生和維持腫瘤細(xì)胞惡性表型有著密切的關(guān)系，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶可以通過(guò)調(diào)節(jié)多胺的含量在細(xì)胞增殖、分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。 胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在我國(guó)的死亡率居惡性腫瘤之首。胃癌的致病因素較多，發(fā)病機(jī)理尚未完全闡明。早期胃癌患者無(wú)任何

2、癥狀或癥狀缺乏特異性，因此胃癌的早期診斷較為困難，病人就診往往是晚期，死亡率較高。目前，治療胃癌首選手術(shù)及術(shù)后常規(guī)化療，手術(shù)后5年生存率只能到40％。胃癌治療的其他方法正在探索中。國(guó)外報(bào)道鳥(niǎo)氨酸脫羧酶水平在多種癌組織中增高。但是，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶與胃癌的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道。 為了研究ODC基因作為胃癌診治靶標(biāo)的可行性，為探討以O(shè)DC為靶標(biāo)建立胃癌早期診斷和基因治療方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對(duì)策，本文首先從組織水平研究了ODC基因表達(dá)與胃癌的關(guān)

3、系，繼而利用ODC反義RNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SGC—7901與GES—1，從細(xì)胞水平觀(guān)察ODC基因下調(diào)抑制胃癌的作用。 實(shí)驗(yàn)方法: 第一部分、 ODC基因在胃癌組織表達(dá)水平的研究 1．半定量RT—PCR檢測(cè)標(biāo)本中ODCmRNA 分別取21例新鮮胃癌標(biāo)本及距腫瘤處7cm外的癌旁組織，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)。其中高中分化10例，低分化11例。按照Trizol試劑盒的說(shuō)明提取結(jié)直腸癌組織及正常組織中的總RNA，

4、用隨機(jī)引物Oligo dT按照試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄（RT）合成cDNA第一條鏈，RT反應(yīng)產(chǎn)物用作PCR的模板DNA，使用特異性引物進(jìn)行PCR。β—actin基因作為內(nèi)參照。取10μl PCR產(chǎn)物在2％瓊脂凝膠電泳，紫外燈下觀(guān)察電泳帶，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描拍照。分析讀取各條帶灰度，并將所獲得的目的基因與作為內(nèi)參的管家基因條帶灰度進(jìn)行比較。通過(guò)在半定量水平測(cè)定21例胃癌患者的癌旁組織和癌組織中的ODC mRNA表達(dá)的相對(duì)水平，觀(guān)察其與臨床病理

5、學(xué)指標(biāo)的關(guān)系。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)和兩個(gè)樣本的t檢驗(yàn)、使用SPSS（12．0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2．Western Blot檢測(cè)標(biāo)本中ODC蛋白表達(dá)量 標(biāo)本經(jīng)常規(guī)處理后，剪碎，用組織裂解液RIPA制備勻漿，提取總蛋白并測(cè)定濃度，經(jīng)SDS—PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育及顯色得出結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1．21例胃癌標(biāo)本中ODC

6、 mRNA表達(dá)豐度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，癌組織1．25±0．34，癌旁正常組織為0．36±0．18，胃癌組織ODC mRNA表達(dá)量較癌旁正常粘膜組織顯著升高，差異顯著（P<0．01）。低分化胃癌ODC mRNA表達(dá)量較高中分化顯著升高，差異顯著（P<0．01）。 2．Western Blot顯示腸癌組織中ODC蛋白表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織。 結(jié)論： 本文證明胃癌組織中ODC基因表達(dá)增高，并且低分化胃癌ODC的基因

7、表達(dá)量高于高中分化胃癌，表明胃癌的發(fā)生和發(fā)展與ODC的表達(dá)有關(guān)。上述研究結(jié)果提示ODC可作為胃癌基因診斷的靶分子，也初步提示ODC基因可作為胃癌基因治療的靶標(biāo)。 第二部分、抑制ODC基因的表達(dá)與胃癌細(xì)胞株生長(zhǎng)、侵襲能力關(guān)系的研究 實(shí)驗(yàn)方法： 1．鳥(niǎo)氨酸脫羧酶pcDNA—ODCr反義載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株，Western—blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中ODC的表達(dá) pcDNA—ODCr載體帶有ODC蛋白質(zhì)編碼

8、區(qū)的反義序列，采用脂質(zhì)體包被該反義載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC—7901與胃永生化細(xì)胞GES—1。同時(shí)設(shè)計(jì)空白pcDNA3．1轉(zhuǎn)染對(duì)照組與空白對(duì)照組。Western—blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中ODC蛋白質(zhì)的表達(dá)量，并與空白pcDNA3．1載體轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組進(jìn)行比較。 2．細(xì)胞活性檢測(cè)法（MTS）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株的增殖能力 用MTS法檢測(cè)反義載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞、空白載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞以及空白對(duì)照組細(xì)胞的增殖活性。檢測(cè)時(shí)刻分別是

9、轉(zhuǎn)染后0h，24h，48h，72h，并繪制細(xì)胞的增殖曲線(xiàn)。 3．檢測(cè)轉(zhuǎn)染后癌細(xì)胞株的侵襲能力 用Transwell小室檢測(cè)反義載體轉(zhuǎn)染組腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，并與空白pcDNA3．1組和空白對(duì)照組進(jìn)行比較。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1．Western blotting結(jié)果顯示反義載體轉(zhuǎn)染后，胃癌細(xì)胞株ODC蛋白表達(dá)量明顯降低。 2．繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)，反義載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC—7901與胃永生化細(xì)胞GES—1細(xì)

10、胞后，兩株細(xì)胞的增殖活性均較對(duì)照組明顯降低，抑制率分別為60％和57％。 3．Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶pcDNA—ODCr反義載體可以抑制胃癌細(xì)胞SGC—7901和胃永生化細(xì)胞GES—1的侵襲能力。 結(jié)論： ODC反義載體pcDNA—ODCr可以下調(diào)胃癌細(xì)胞株中的ODC表達(dá)量，轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞株增殖與侵襲能力下降，表明ODC基因下調(diào)能起到治療胃癌的作用。 總之，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明OD