黑殼子粳抗稻瘟病基因Pi-hkl候選基因的克隆和初步功能驗證.pdf

1、由子囊菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是世界性水稻病害之一，嚴重威脅水稻生產(chǎn)。開展抗稻瘟病新基因的鑒定和功能分析對抗病育種具有重要的現(xiàn)實意義。太湖流域的地方粳稻品種黑殼子粳是一個廣譜高抗的水稻品種，對多個稻瘟病菌株表現(xiàn)穩(wěn)定持久的抗性。前期研究通過日本鑒別菌株北1在11號染色體上定位到主效抗稻瘟病性基因Pi-hk1，進一步定位于RM7654和In5區(qū)間內。本研究在Pi-hk1前期精細定位和物理作圖的基礎上，對候選基因進行克

2、隆、生物信息學分析和表達分析，并通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化方法獲得轉基因植株，對候選基因進行了初步功能分析，結果如下:
　　1.定位區(qū)間內有4個ORF:P13編碼含有MybDNA結合結構域的蛋白，與日本晴序列一致，與感病品種蘇御糯存在一個氨基酸的差異;P14是反轉座子;P15和P16基因的編碼蛋白具有典型NBS-LRR抗病結構;P15蛋白在日本晴和蘇御糯中存在多處氨基酸插入與替換，并含有日本晴和蘇御糯中都不存在的兩個串聯(lián)的WRKY結

3、構域;P16基因的編碼蛋白與日本晴的相似性達到92％。與日本晴中不同，黑殼子粳中P15、P16編碼方向相反，兩個基因的轉錄起始位點相距189bp。
　　2.利用實時熒光定量PCR技術，對黑殼子粳和蘇御糯在稻瘟病菌接種0、4、8、12、24、48、72h后，3個候選基因表達情況進行分析。結果表明3個候選基因均為組成型表達，并明顯受到稻瘟病菌接種誘導。在抗病品種黑殼子粳中，稻瘟病菌脅迫4h后，3個基因的表達即有明顯上調，早于感病品種蘇

4、御糯中基因的表達。
　　3.擴增3個候選基因的cDNA全長或基因組編碼序列全長，構建候選基因的過表達載體;利用覆蓋定位區(qū)間的BAC質粒，構建了包含P15、P16基因組全長的共轉化載體，并進一步構建了P15和P16的功能互補載體;以感病品種蘇御糯作為受體進行遺傳轉化，分別獲得了相應的轉基因陽性株系。
　　4.對T2代P13過表達轉基因陽性株系、T1代P16過表達轉基因陽性株系進行稻瘟病菌噴霧接種，結果表明，過表達P13和過表達