HL-CMS不育候選基因orf216的克隆及稻瘟病抗性基因Pi36的功能研究.pdf

1、水稻（Oryza sativa L.）是世界最重要的糧食作物之一。上個世紀，以植物細胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)為基礎(chǔ)的“三系”雜交稻的利用使水稻的產(chǎn)量發(fā)生了飛躍的變化。目前，一方面由于世界人口的不斷增長和耕地面積的不斷減少，另一方面以病原菌和害蟲等生物脅迫引起水稻的減產(chǎn)，使得目前世界的糧食問題尤為突出。因此，通過對作物品種的遺傳改良以提高單位面積產(chǎn)量，將是解決人類對糧食的需求不斷增加這

2、一矛盾的主要途徑。
　　 本研究在已有的HL-CMS不育相關(guān)片段HL-sp1分離和克隆基礎(chǔ)上，利用TAIL-PCR技術(shù)進一步擴增其側(cè)翼序列，對HL-sp1進行了結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測分析，并進行了遺傳轉(zhuǎn)化。采用RNAi技術(shù)以及亞細胞定位技術(shù)對稻瘟病抗性基因Pi36的功能進行了初步研究。取得了以下研究結(jié)果：
　　 1. HL-sp1側(cè)翼序列的分析及基因預(yù)測采用單引物PCR以及改良的TAIL-PCR技術(shù)，成功地獲得了HL-sp1 5

3、’端2009 bp及3’端2555 bp的序列，將HL-sp1延伸至6740 bp。通過BLSAT序列比對，發(fā)現(xiàn)HL-sp1缺失了線粒體基因atp6 的1-1772 bp，而且5’端近1700 bp序列與秈稻9311的線粒體序列同源性非常小，而與玉米的T-CMS和C-CMS線粒體DNA序列有部分的同源性。利用2種基因預(yù)測軟件RiceGAAS (http://ricegaas.dna.affrc.go.jp)和Softberry的FGEN

4、ESH (http://www.softberry.com) 對HL-sp1進行了基因預(yù)測及注釋分析。結(jié)果表明該序列包含2個ORFs。第一個ORF全長171bp，由4個不連續(xù)的較短的外顯子組成，編碼一個功能未知的蛋白；另外一個ORF由651bp組成，是一個獨立的外顯子，編碼216個氨基酸，暫命名這個候選基因為orf216，通過與9311線粒體序列比對發(fā)現(xiàn)，orf216是由2個相差較遠的基因的部分編碼區(qū)和一個未知片段所組成的嵌合基因。

5、r>　　 2. HL-CMS不育候選基因orf216的細胞質(zhì)特異性及表達分析以不育候選基因orf216的序列設(shè)計了特異性引物對水稻3種不同CMS類型的不育系、保持系、恢復(fù)系及雜交種進行PCR分析，證明不育候選基因orf216只存在于具有紅蓮型不育胞質(zhì)的品種中。進一步利用反轉(zhuǎn)錄PCR對不育候選基因orf216進行了表達模式分析，初步結(jié)果表明該基因為組成型表達。
　　 3. HL-CMS相關(guān)不育候選基因orf216的克隆與遺傳轉(zhuǎn)化

6、利用已經(jīng)克隆的BT型水稻育性恢復(fù)基因Rf1b的線粒體定位信號肽序列和雙元載體轉(zhuǎn)化體系pCAMBIA1305.1，成功地構(gòu)建了重組植物表達載體。以與紅蓮型不育系粵泰A（YTA）同核異質(zhì)的保持系粵泰B（YTB）作為受體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了候選基因的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)化植株。對T0代轉(zhuǎn)化植株進行了選擇標記潮霉素基因和目的基因的PCR分子檢測。結(jié)果表明候選基因成功地插入受體品種的基因組中。
　　 4. 稻瘟病抗

7、性基因Pi36 RNAi干涉載體的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化利用植物干涉表達載體pCAMBIA1300RS成功地構(gòu)建了Pi36的5’端、3’端和NBS保守結(jié)構(gòu)域的3個植物RNA干涉表達載體，分別將這些重組載體轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105后，對水稻抗病品種Q61進行遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)過分子鑒定后，獲得了一批陽性轉(zhuǎn)化植株。熒光定量PCR分析表明，3個干涉載體的轉(zhuǎn)化植株中目的基因Pi36的表達量均有不同程度的下降，其中以O(shè)RF 5’端的片段構(gòu)建的載體干涉程度最