稻瘟病菌Mgvam7基因的克隆與功能分析.pdf

1、稻瘟病是世界上最嚴重的糧食作物病害之一，由于稻瘟病菌研究的重要經(jīng)濟和社會意義及稻瘟病菌容易培養(yǎng)、遺傳轉化體系成熟等特點，稻瘟病菌已經(jīng)成為植物病原真菌研究的模式系統(tǒng)，膜泡運輸對于蛋白質的運輸和分泌至關重要，其中SNARE蛋白是膜泡運輸過程中十分保守的一類蛋白。稻瘟病菌在侵染植物過程中分泌大量的外泌蛋白，而迄今關于膜泡運輸系統(tǒng)在植物病原真菌的致病性及其生長發(fā)育、細胞分化等方面的作用鮮有報道。為了分析膜泡運輸相關組分在稻瘟病菌中的功能，本研究

2、對稻瘟病菌膜泡運輸SNARE蛋白基因Mgvam7的功能進行了研究。 首先根據(jù)同源序列比對，在稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫搜索到一個與酵母vam7基因同源的基因，命名為Mgvam7，序列分析表明該基因編碼的蛋白含有375個氨基酸，其氨基酸序列與酵母的SNARE蛋白vamp7的同源性僅為24％,該蛋白包含一個PX結構域和一個SNARE結構域；該基因可以互補酵母vam7基因突變體在含有CalcoflourWhite(CFW)的培養(yǎng)基平板上的生

3、長缺陷，同時FM4-64染色顯示該基因能夠互補酵母突變體液泡形態(tài)上的缺陷，表明該基因編碼一個具有SNARE蛋白功能的VAM7蛋白。進一步將報告基因eGFP構建在Mgvam7基因的啟動子下游來分析該基因表達的組織特異性，結果發(fā)現(xiàn)該基因在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞階段均有表達。 采用原生質體轉化和同源重組技術獲得了稻瘟病菌的Mgvam7敲除突變體，對其多種生物學表型進行了分析，結果顯示突變體對金屬離子、營養(yǎng)、滲透壓等液泡功能相關的

4、脅迫耐受性減弱，已證明在稻瘟病菌中，脂肪粒主要主要存在于液泡中，可以通過采用Nile red染色法觀察脂肪粒來分析液泡形態(tài)的變化。該染色法發(fā)現(xiàn)，與野生型菌株相比，突變體脂肪粒增多，且多呈碎球狀，表明突變體的液泡發(fā)生片段化。細胞壁和細胞膜脅迫因子處理發(fā)現(xiàn)突變體而對SDS更加敏感而對CFW的耐受增加，同時對菌絲進行CFW染色顯示突變體細胞壁幾丁質分布發(fā)生變化。頂體結構是真菌菌絲頂端重要的細胞器，通常與真菌極性生長、細胞壁合成相關。FM4-6

5、4染色觀察到突變體菌絲頂端不能形成正常的頂體結構，同時采用FM4-64跟蹤試驗觀察到突變體不能進行正常的胞吞作用，而BFA處理可以部分恢復突變體的胞吞作用，表明BFA作用于Mgvam7的下游調控胞吞作用。已證明活性氧對真菌發(fā)育和極性生長有重要調節(jié)作用，利用熒光染料對菌絲頂端活性氧染色發(fā)現(xiàn)突變體內(nèi)活性氧積累顯著減少。進一步產(chǎn)孢分析發(fā)現(xiàn)突變體存在嚴重的產(chǎn)孢缺陷，采用菌絲片段離體接種發(fā)現(xiàn)突變體均不能侵染大麥和水稻。 綜上研究表明Mgv