花生油脂合成關(guān)鍵酶基因DGAT3、SAD的分子特征分析與FAD2的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花生是世界四大油料作物之一，在全世界范圍內(nèi)的熱帶和亞熱帶地區(qū)廣為種植。中國是世界上花生生產(chǎn)和消費較多的國家之一。因此，提高我國花生油脂的品質(zhì)意義重大。二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)是油料作物儲存脂類三酰甘油(TAG)合成途徑的限速酶，△9－硬脂酰－ACP脫氫酶(SAD)和微粒體△12-脂肪酸脫氫酶(FAD2)是控制油酸含量的關(guān)鍵酶。本研究利用RT-PCR技術(shù)以及以基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增方法，克隆了花生DGAT3的DNA，并分別克

2、隆了花生栽培品種和二倍體野生種的DGAT3，通過序列分析，從分子進(jìn)化角度對花生栽培種與野生種之間的親緣關(guān)系進(jìn)行了探討；獲得了栽培品種和二倍體野生種SAD的DNA序列和兩條cDNA序列，并構(gòu)建了攜帶SAD的表達(dá)載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反義ahFAD2B轉(zhuǎn)入花生栽培品種得到T0代和T1代陽性轉(zhuǎn)化植株。取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)花生DGAT3的克隆及序列分析
　　 從栽培種山花7號克隆到2條DGAT3cDNA片段，

3、命名為ShrDGAT3－1和ShrDGAT3－2，二者核苷酸序列同源性96.9％。ShrDGAT3－1全長1186bp，編碼340個氨基酸；ShrDGAT3－2全長1201bp，編碼345個氨基酸；推導(dǎo)的氨基酸序列DGAT3－1和DGAT3－2同源性96.0％，兩序列均具有部分保守DGAT功能基序，但DGAT3－1在?；蚪饷钢虚g介導(dǎo)區(qū)135TNPDCESSSSSSSSESESES154缺失了SSES四個氨基酸。從山花7號中克隆到2條D

4、GAT3 DNA序列，命名為ShgDGAT3-1和ShgDGAT3-2，二者核苷酸序列同源性93.7％，均含有1個內(nèi)含子；序列差異分析表明二者多態(tài)性位點豐富，限制性內(nèi)切酶AccIII可用于鑒別兩個DGAT3基因。
　　 (2)花生DGAT3的分子進(jìn)化分析
　　 從12個栽培品種分別克隆得到2條DGAT3DNA片段，命名為gDGAT3-1和gD6AT3-2；gDGAT3-1在12個品種間核苷酸序列同源性為100％，gDGA

5、T3-2同源性為99.9％。從6個花生區(qū)組二倍體野生種中均克隆獲得到1條DGAT3DNA片段。以山花7號獲得的兩條序列ShgDGAT3-1、ShgDGAT3-2和AdurgDGAT3，AcorgDGAT3，AvilgDGAT3，AcargDGAT3，AipagDGAT3，AbatgDGAT3構(gòu)建進(jìn)化樹，ShgDGAT3-1與AvilgDGAT3和AcargDGAT3聚為一組；ShgDGAT3-2與AipagDGAT3聚為一組。推測gDG

6、Ar3-1和gDGAT3-2分別來自花生栽培種的A、B兩個染色體組。
　　 (3)花生SAD的克隆及序列分析
　　 從栽培品種豐花2號克隆到2條SADcDNA片段，命名為FhrSAD-1和FhrSAD－2，二者核苷酸序列同源性98.6％，其中編碼區(qū)序列同源性98.9％，共有12個變異位點，編碼的Ah－SAD2氨基酸序列與Ah－SAD1相比在N端的17PSSSSSSSSSSFSL30絲氨酸聚集區(qū)少一個絲氨酸。同時獲得花生區(qū)

7、組二倍體野生種A.duranensis和A.ipaensis1條SADDNA片段(命名為gSAD-A和gSAD-B)及3個栽培品種的SAD，每個栽培品種有兩個SAD(命名為gSAD－1和gSAD-2)。豐花2號的FhgSAD-1和FhgSAD-2均含有2個內(nèi)含子，二者同源性97.5％，共有69個變異位點，其中62個是SNP位點、6個特異性酶切位點。gSAD－1和gSAD-A同源性為99.9％，存在4個SNP位點；gSAD-2和gSAD-

8、B同源性為100％。推測gSAD－1和gSAD-2分別來自花生栽培品種的A、B兩個染色體組。
　　 (4)花生SAD植物表達(dá)載體構(gòu)建
　　 用限制性內(nèi)切酶HindIII、PstI對攜帶FhrSAD-2的重組質(zhì)粒pEASY－T1和植物表達(dá)載體pGBVE進(jìn)行酶切，回收目的片段和表達(dá)載體連接，經(jīng)PCR檢測和酶切鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得攜帶FhrSAD-2的表達(dá)載體pSAD-2。
　　 (5)獲得含反義a