黃瓜熱激因子結(jié)合蛋白1（CsHSBP1）基因的克隆與功能分析.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文黃瓜熱激因子結(jié)合蛋白1（CsHSBP1）基因的克隆與功能分析姓名：侯瑞賢申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：張興國(guó)20050101西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文曼—■_IIIIII蔓童——■|皇曼置皇——■甍皇曼罡簟■曹■■—量詈皇皇鼉曼曼薯——詈量穹曼!寰摹皇目皇■—魯曼■舅量舅I隆法連接到pMDl8T克隆載體(Takara公司)上。通過(guò)菌液和質(zhì)粒PCR擴(kuò)增檢測(cè)等方法確認(rèn)剛性克隆和確定日的基因的插入方向，得到了C

2、sHSBPI基因的編碼區(qū)克隆，便于今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行CsHSBPJ基因的功能分析。2CsHSBPl基因及其推導(dǎo)氨基酸序列的同源性分析根據(jù)已知CsHSBPl基因的eDNA序列推導(dǎo)氨基酸序列。通過(guò)網(wǎng)上在線服務(wù)器BLASTp程序?qū)Σ煌锓N間HSBPl蛋白的氨基酸序列進(jìn)行Fi巍性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsHSBPl蛋白與植物中擬南芥(Ambidopsisthaliana)HSBPI蛋白的同源性最高，可達(dá)76％，而與動(dòng)物、微生物中HSBPI蛋白的同

3、源性較低，最低只有3034％。3CsIISBPl基因及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析31CsHSBPl基因結(jié)構(gòu)分析分別以黃瓜基因組DNA和含有CsHSBPl基因全長(zhǎng)eDNA序列的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，比較CsHSBPl基因在基因組DNA和eDNA中的大小。lyon脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，從基因組DNA和eDNA中擴(kuò)增出的特異性目的片段大小一致，長(zhǎng)度為340bp左右，因此推測(cè)該基因沒(méi)有內(nèi)含子。CsHSBPl基因eDNA序列全長(zhǎng)535bp

4、，編碼89個(gè)氨基酸其中，5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、編碼區(qū)(CDS)和3’UTR分別長(zhǎng)69bp、270bp和196bp。該基因序列內(nèi)，含有7的I、Sau3A、A／uI等限制性酶切位點(diǎn)，不含有EcoRI、EeoRV、BamHI、Hind19等酶切位點(diǎn)。32CsHSBPI蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析將不同物種問(wèn)HSBPI蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析親緣關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CsHSBPI蛋白與擬南芥、玉米、水稻等HSBPI同屬一個(gè)太分支，肯定了CsHSBPI蛋白與

5、植物HSBPl具有較近的親緣關(guān)系。CsHSBPI蛋白通過(guò)Coils21的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，3466殘基位點(diǎn)處存在一個(gè)疏水七價(jià)重復(fù)區(qū)，36殘基位點(diǎn)的卷曲程度最大：Vector90與AnthewinV50程序?qū)sHSBPl蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋自理化性質(zhì)的分析結(jié)果顯示，CsHSBPI蛋白中a一螺旋含量較高，沒(méi)有跨膜區(qū)域；三級(jí)結(jié)構(gòu)中的疏水殘基比較集中地位于卷曲結(jié)構(gòu)一側(cè)，形成伸展面積較大的疏水表面。4CsttSBPl基因的基因組拷貝數(shù)分析以PCR擴(kuò)