ALV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立及重組腺病毒介導(dǎo)的RNAi抑制ALV-J復(fù)制的研究.pdf

1、J亞群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis virus，ALV-J)是一種最常見的外源性禽白血病病毒，自1999年我國首次從商品代肉雞中分離得到之后，全國各地相繼報(bào)道了ALV-J的感染。ALV的感染可能會(huì)造成雞群生長遲緩、產(chǎn)蛋率和受精率等生產(chǎn)性能的降低、腫瘤發(fā)生，同時(shí)會(huì)造成感染雞的免疫抑制，給我國養(yǎng)雞行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而目前還沒有一種藥物可以治療或者控制AL，除了凈化措施之外，也需要探索一種有效的抗

2、病毒感染的方法。
　　根據(jù)GenBank上ALV各亞群的三個(gè)主要編碼基因gag、 pol、env中的保守序列設(shè)計(jì)了5對特異性引物，分別用于檢測蛋白酶PR、反轉(zhuǎn)錄酶RT、整合酶IN、表面蛋白基因gp85和穿膜蛋白基因gp37。通過RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出5對引物的目的片段，回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，測序正確后的樣品用于制備標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，10倍系列連續(xù)稀釋后進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR，建立檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)繪制熔解曲

3、線。結(jié)果顯示，建立的5條標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為92.6％-100.5％，相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)均超過0.994。經(jīng)過熔解曲線、特異性試驗(yàn)結(jié)果分析，設(shè)計(jì)的5對引物只能擴(kuò)增出ALV病毒，特異性好;敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，可以檢測得到一個(gè)數(shù)量級拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。說明建立的方法敏感性高，可以用于檢測ALV-J病毒各基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的試驗(yàn)。
　　試驗(yàn)通過構(gòu)建重組腺病毒介導(dǎo)的RNAi以研究其在DF-1細(xì)胞上抑制ALV-J毒株HG03病毒復(fù)制的能力，應(yīng)用

4、建立的Real-time PCR方法檢測病毒PR、RT、IN、gp85和gp37基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和囊膜蛋白gp85的表達(dá)水平，經(jīng)內(nèi)參GAPDH校正后計(jì)算出mRNA相對表達(dá)量，與對照組相比判斷其RNAi的抑制效果。首先根據(jù)GenBank中HPRS103毒株(Z46390.1)以及本實(shí)驗(yàn)室所測J亞型毒株HG03 gp85基因保守區(qū)域?yàn)榘行蛄?，遵循siRNA設(shè)計(jì)規(guī)則，以及載體pHBAd-U6-RFP的要求，設(shè)計(jì)了三對寡核苷酸siRNA1

5、、siRNA2和siRNA3。為方便連接載體，序列加入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。干擾序列連接腺病毒載體后，與骨架質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行同源重組，獲得的3個(gè)重組載體分別命名為pAd-gp85-shRNA1、pAd-gp85-shRNA2和pAd-gp85-shRNA3，空載體為pAd-N。經(jīng)測序鑒定正確后，制備重組病毒種子液并測定其滴度，分別達(dá)到1.26×1010PFU/mL、1.58×1010PFU/mL和1.26×1010

6、PFU/mL，空載體滴度為2.0×1010PFU/mL。
　　用構(gòu)建好的重組腺病毒在DF-1細(xì)胞上進(jìn)行RNAi效果的觀察。首先測定重組腺病毒感染DF-1細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)(the multiplicity of infection，MOI)為500。其次，用500 MOI的重組腺病毒感染長成單層的DF-1細(xì)胞，8h后按1×103 TCID50的量接種HG03病毒，接種后48h分別用建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法

7、檢測HG03各基因的mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示構(gòu)建的重組腺病毒載體對HG03各基因都有抑制效果，對gp85基因抑制率為51.6％-82.0％，其中以pAd-gp85-shRNA2的抑制率最高，達(dá)82.0％;對其它4個(gè)基因的mRNA相對表達(dá)量也有所下調(diào)，不同的基因下調(diào)的幅度不同。IFA檢測的結(jié)果顯示，干擾組的熒光強(qiáng)度明顯弱于陽性對照組的，而空載體對照組與陽性對照組的熒光強(qiáng)度沒有明顯區(qū)別，結(jié)果與Real-time PCR檢測的相符。