J亞群禽白血病病毒受體的分離鑒定及研究.pdf

1、禽白血病病毒(avian leukosis virus，ALV)可以致禽發(fā)生多種類型的腫瘤，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒。根據(jù)病毒囊膜蛋白的抗原性，分為A-J等10個亞群，其中A，B，C，D，E和J亞群能夠感染雞。J亞群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J，ALV-J)是1980年代由Payne等[1]人從肉雞中首次分離鑒定。
　　反轉(zhuǎn)錄病毒env囊膜蛋白含有兩個表面亞單位:一個是SU蛋白(surface

2、 unit，SU)，另外一個是TM蛋白。SU蛋白含有病毒-受體相互作用的決定簇，能夠介導(dǎo)病毒與宿主細胞結(jié)合，是決定宿主范圍的關(guān)鍵因素，病毒與宿主細胞表面受體的結(jié)合是啟動病毒感染的第一步，也是最為關(guān)鍵的一步。病毒粒子一旦與受體結(jié)合，即會激活病毒與細胞的融合[2]。
　　在反轉(zhuǎn)錄病毒中，目前已被鑒定的病毒受體已有很多。例如，貓免疫缺陷病毒(FelineImmunodeficiency Virus，F(xiàn)IV)利用CD4和CD134作為感染

3、宿主細胞的主要受體[1];人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)利用CD4、CCR5和CXCR4分別作為主要受體和共受體[2]感染人CD4 T細胞;同時，CD4、CCR5和CXCR4亦作為猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus，SIV)的受體參與SIV的感染過程[3]。然而，SIV卻廣泛地使用各種共受體分子介導(dǎo)病毒感染，例如:CCR1、CCR2b、CCR3、

4、CCR8、GPR1、GPR15以及其他多種細胞因子受體[4]。這些病毒受體的鑒定為深入研究、了解病毒感染機制和為人類控制疾病發(fā)揮了很好的作用。
　　到目前為止，禽白血病病毒受體分離鑒定研究中，已有四種受體蛋白得到鑒定，分別是Tva, Tvb，Tvc和chNHE1。其中，Tva, Tvc和chNHE1分別介導(dǎo)A亞群[5],C亞群[6]和J亞群[7]禽白血病病毒的感染，而Tvb負責編碼B亞群，D亞群[8]和E亞群[9]禽白血病病毒受體

5、。禽白血病病毒曾經(jīng)作為分析病毒進入宿主細胞的模型用于病毒感染研究[10]，發(fā)揮了很好的作用。然而，本世紀初禽白血病尤其是J亞群禽白血病的感染發(fā)生很大變化，尤其是在中國出現(xiàn)嚴重問題，ALV-J從肉用雞群發(fā)展到蛋雞群[11]，中國的一些地方品種雞群也可以感染;由單獨引起病雞發(fā)生髓細胞瘤、血管瘤發(fā)展至可同時引起病雞的血管瘤、髓細胞瘤，甚至引發(fā)病雞同時產(chǎn)生血管瘤、髓細胞瘤和平滑肌瘤[12];近幾年，相繼有報道指出ALV-J在雞體內(nèi)與其他免疫抑制

6、病毒（如MDV[13]、REV[14]）發(fā)生共感染現(xiàn)象。這些現(xiàn)象的發(fā)生一方面可能是由于在自然選擇壓下，env基因可變區(qū)的快速變異或基因重組導(dǎo)致病毒毒力和致瘤性的增強以及宿主感染范圍的擴大，但更重要的可能是在病毒的感染上存在新的受體。當然，ALV-J gp85基因序列不同程度的變異也可能會導(dǎo)致ALV-J的組織嗜性和細胞受體類型發(fā)生變化，繼而影響到宿主的范圍。
　　為此，本研究利用J亞群禽白血病病毒為模型，通過免疫共沉淀、質(zhì)譜分析、熒

7、光定量PCR等技術(shù)進行了ALV-J新受體的分離鑒定和特性分析。
　　1.ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因在腺病毒表達系統(tǒng)中的融合表達
　　首先將本實驗室構(gòu)建的SUJ-rIgGFc基因克隆進pShuttle-CMV載體中，構(gòu)建腺病毒重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV-SUJ-rIgGFc;重組質(zhì)粒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細胞，在感受態(tài)細胞內(nèi)與腺病毒骨架pAdEasy-1同源重組及抗性篩選獲得重組

8、腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc;重組腺病毒質(zhì)粒pAd-SUJ-rIgGFc經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)染人293T細胞獲得重組腺病毒rAd-SUJ-rIgGFc。通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)和免疫熒光試驗(FA)分析并證明目的基因SUJ-rIgGFc通過腺病毒表達載體在293T細胞中得到很好地表達，且融合蛋白主要分布于293T細胞膜，可被ALV-J特異性單克隆抗體JE9和羊抗兔IgG所識別;Westernblot試驗結(jié)果表明，融合蛋白大小在90

9、-95kd左右，與JE9以及羊抗兔IgG均有很好的反應(yīng)性。同時，將重組病毒感染MDCK細胞，利用免疫熒光試驗分析，表明重組病毒能夠感染MDCK細胞，融合蛋白在MDCK細胞中表達良好。本研究利用腺病毒表達系統(tǒng)在人293T細胞成功融合表達了ALV-J gp85基因和兔IgG Fc基因，獲得了能夠表達目的基因的重組病毒;同時，通過MDCK擴增重組病毒，收獲并純化融合蛋白，為下一步分離ALV-J受體提供了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　2.J亞群禽

10、白血病病毒受體的分離鑒定和質(zhì)譜分析
　　利用DF1細胞系和pcDNA-env DF1細胞系作為受體供體細胞，為免疫共沉淀試驗提供目的蛋白，同時采用兩種方案進行免疫共沉淀試驗。方案一，將DF1細胞膜蛋白與融合蛋白SUJ-rIgGFc、protein A agarose進行免疫共沉淀試驗，沉淀產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和銀染后，切膠并進行質(zhì)譜鑒定。方案二，pcDNA-env DF1細胞經(jīng)裂解后分離膜蛋白，與抗ALV-Jenv蛋白單克隆抗體

11、JE9、protein A agarose resin進行免疫共沉淀試驗，沉淀洗脫蛋白經(jīng)SDS-PAGE和銀染后，切膠，進行質(zhì)譜分析。SDS-PAGE結(jié)果顯示，兩種方案獲得的免疫共沉淀產(chǎn)物中均得到約80kd和38kd的兩個蛋白條帶。經(jīng)質(zhì)譜分析，這兩種蛋白分別是78kd葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated Protein，GRP78)和膜聯(lián)蛋白A2（annexin，ANXA2）。提示，本研究分離的能夠與ALV-J SU蛋白特

12、異結(jié)合蛋白是ALV-J疑似受體，為進一步鑒定和驗證疑似受體奠定了基礎(chǔ)。
　　3.GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒感染中的功能分析
　　通過抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗在DF1細胞中進行感染抑制試驗，以檢驗GRP78和ANXA2在J亞群禽白血病病毒粒子進入靶細胞或在早期感染過程中是否發(fā)揮著受體的功能。首先，利用抗GRP78和抗ANXA2多抗封閉DF1細胞表面GRP78和ANXA2，然后用ALV-J感染DF1細胞

13、，并用甘氨酸處理滅活細胞外的病毒粒子，48小時后通過間接免疫熒光試驗、免疫印跡試驗、熒光定量PCR分別檢測細胞中ALV-J env的表達水平，同時通過測定細胞上清中的ALV-J的TCID50鑒定病毒效價，從而判定抑制病毒感染的效果。試驗結(jié)果顯示，經(jīng)多抗封閉的DF1細胞中ALV-J env的表達水平均有所下降。病毒滴度測定結(jié)果顯示，當抗體濃度達到50μtg/mL時，抗GRP78多抗和抗ANXA2多抗對病毒感染的抑制率分別可達到93.2％和

14、98.4％; IFA和Western blot結(jié)果顯示，隨著阻斷抗體濃度的加大，DF1細胞中ALV-J env蛋白表達越來越少，病毒滴度也顯著降低，而作為對照，抗體對ALV-A的感染無抑制作用。結(jié)果表明，病毒感染所需的受體被特異性抗體所封閉，啟動病毒感染的第一步即病毒與受體的結(jié)合被有效阻斷，從而導(dǎo)致病毒感染率的下降。本研究中，細胞表面GRP78和ANXA2的缺失是導(dǎo)致ALV-J感染率的急劇下降甚至出現(xiàn)ALV-J的感染失敗的根本原因，表明

15、GRP78和ANXA2是ALV-J的受體。
　　4.J亞群禽白血病病毒受體chGRP78和chANXA2重建試驗
　　chGRP78和chANXA2作為J亞群禽白血病病毒受體，能夠介導(dǎo)ALV-J進入宿主細胞從而啟動病毒感染。那么，如果在非易感細胞表面建立同樣的受體模型，ALV-J是否還能感染非易感細胞？或者，chGRP78和chANXA2是否還具有介導(dǎo)ALV-J進入非易感細胞的功能？為此，本研究利用人胚腎細胞（HEK293T

16、細胞）和鵝胚成纖維細胞(GEF)作為受體重建靶細胞，以DF1細胞總RNA為模板擴增chGRP78和chANXA2基因全序列，并構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-chGRP78和pcDNA3.1-chANXA2。chGRP78和chANXA2分別或共同轉(zhuǎn)染GEF或293T細胞，轉(zhuǎn)染48小時候后感染ALV-J(M.O.I=5)，并于感染后不同時間點收獲細胞，通過間接免疫熒光試驗或熒光定量PCR方法檢測細胞內(nèi)ALV-J env的表達。ALV-

17、J(M.O.I=5)感染表達chGRP78和/或chANXA2的GEF細胞，病毒吸附2小時候甘氨酸(Ph3.0)滅活未進入細胞的病毒粒子，48小時候收獲GEF細胞并裂解，將細胞裂解物接種DF1細胞，培養(yǎng)7天后，利用間接免疫熒光試驗(IFA)檢測病毒增殖情況。IFA結(jié)果顯示，共表達chGRP78和chANXA2的GEF細胞以及表達chANXA2的GEF細胞裂解物接種的DF1細胞均能產(chǎn)生可見的特異性熒光，而表達chGRP78或空載體的GEF

18、細胞裂解物接種的DF1細胞未見特異性熒光，說明chANXA2和chGRP78在GEF細胞中的表達有效地介導(dǎo)并協(xié)助了病毒粒子進入細胞，完成了病毒感染關(guān)鍵的第一步;而在兩個受體之間，chANXA2應(yīng)該較chGRP78承擔著更為主要的作用或角色。
　　同時，表達chGRP78或chANXA2的293T細胞在感染ALV-J后，通過real-time PCR檢測感染后12h、24h、48h和72h四個時間點293T細胞內(nèi)ALV-J env基

19、因的相對表達水平。結(jié)果顯示，表達chGRP78或chANXA2的293T細胞內(nèi)ALV-J env基因的相對表達水平相對空載體轉(zhuǎn)染的293T細胞要高得多。在感染后48小時內(nèi)，表達chGRP78的293T細胞中ALV-J env基因的相對表達水平出現(xiàn)上升，并于48小時達到最高值;表達chANXA2的293T細胞中ALV-J env基因的相對表達水平在72h出現(xiàn)持續(xù)上升趨勢;而共表達chGRP78和chANXA2的293T細胞中env的相對表

20、達水平亦呈現(xiàn)上升趨勢，并在48h達到最高。研究結(jié)果表明，chGRP78和chANXA2在293T細胞中獲得表達，且ALV-J env的mRNA相對表達水平呈現(xiàn)動態(tài)變化的過程，說明ALV-J病毒粒子確實能夠借助293T細胞表面表達的chGRP78或chANXA2進入細胞，證明兩種蛋白對介導(dǎo)病毒進入細胞確實發(fā)揮了重要作用;而比較293T細胞的熒光定量PCR結(jié)果可見，與chGRP78相比較，chANXA2在病毒感染中應(yīng)該發(fā)揮著更為主要的作用。