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文檔簡介
1、J亞群禽白血病病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)屬于反轉(zhuǎn)錄病毒,可以引起雞免疫抑制和多發(fā)性腫瘤。由于ALV-J變異速度快,機(jī)體較難獲得有效的免疫保護(hù),目前尚無防治該病的有效疫苗。天然免疫是機(jī)體抗感染的首要防線,病毒入侵后會被天然免疫系統(tǒng)識別,進(jìn)而引發(fā)相關(guān)免疫通路的活化和抗病毒反應(yīng)。天然免疫識別受體中Nod樣受體(Nod-like receptors,NLRs)、RIG-I樣受體(RIG-I
2、-like receptors,RLRs)在抗RNA病毒中發(fā)揮著重要作用。本研究對ALV-J感染早期時黑色素瘤分化相關(guān)基因5(MDA5)及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成員NLRP3炎癥轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討,為揭示ALV-J致病機(jī)制和宿主抗病毒免疫機(jī)制提供參考。
首先,將本實驗室分離的ALV-J
3、臨床株(命名為AJV-HF211)進(jìn)行DF-1細(xì)胞增殖和鑒定,再將70只1日齡SPF雞隨機(jī)分為兩組,攻毒組42只,對照組28只,經(jīng)頸部皮下接種ALV-HF211細(xì)胞毒,0.2mL/只,2x104TCID50/mL,對照組接種細(xì)胞培養(yǎng)液,0.2mL/只。在感染不同天數(shù)后(days post infection,dpi)剖檢觀察病變,取肝臟制備石蠟切片。結(jié)果表明,攻毒組雞胸腺出血、萎縮,肝臟和脾臟有出血點,膽囊萎縮、膽汁量少且呈淡黃色。此外
4、,AJV-HF211毒株感染組織中炎性細(xì)胞增殖明顯。
其次,通過RT-PCR方法檢測雞肝組織中病毒的核酸片段并設(shè)計擴(kuò)增MDA5、NLRP3及其下游caspase-1及細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、IFN-β和IFN-γ基因片段的特異性引物,進(jìn)一步建立SYBR GreenⅠ實時熒光相對定量 RT-PCR檢測方法(RT-qPCR),分別檢測感染組和對照組雞肝組織內(nèi)的MDA5、NLRP3及其下游接頭分子和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。RT-
5、PCR檢測ALV-J結(jié)果表明,在感染9dpi,首次檢測到ALV-J特異性基因片段,且9-17dpi期間均能檢測到該片段的存在。RT-qPCR結(jié)果表明,與未攻毒的對照組相比,AJV-HF211毒株感染可誘導(dǎo)雞體內(nèi) MDA5、NLRP3及其下游caspase-1、IL-1β和IL-18基因的轉(zhuǎn)錄水平均有不同程度增加,而IFN-β和IFN-γ的表達(dá)無明顯變化。其中,NLRP3/caspase-1在1-3 dpi表達(dá)變化不明顯,而在5-7 dp
6、i時明顯升高(p<0.01),在9dpi開始下降;IL-1β和IL-18在1-5dpi無明顯變化,在7-17dpi表達(dá)量明顯升高(p<0.05)。這表明炎癥初期NLRP3轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,且變化趨勢和caspase-1、IL-1β和IL-18基因基本一致。MDA5在1-5dpi時變化不明顯,但在7-17dpi保持較高轉(zhuǎn)錄水平趨勢。上述結(jié)果提示,NLRP3/caspase-1炎癥通路和MDA5受體在 AJV-HF211感染早期可能發(fā)揮重要
7、作用,而AJV-HF211毒株可能通過負(fù)向調(diào)控干擾素誘生機(jī)制逃逸免疫應(yīng)答。
最后,將雞飼養(yǎng)至240日齡,觀察腫瘤發(fā)生情況,并取肝臟組織制作石蠟切片, HE染色觀察細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果表明,AJV-HF211毒株感染部分雞精神萎靡,食欲不振,羽毛蓬亂,伴有腹瀉消瘦,貧血等癥狀;剖檢觀察到肝臟、心臟、卵巢均有實質(zhì)性增生物出現(xiàn)。石蠟切片HE染色結(jié)果表明,攻毒組肝臟有明顯的腫瘤灶,表現(xiàn)為髓細(xì)胞瘤和血管瘤。此外,還可見淋巴樣細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞索
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