凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、凡納濱對(duì)蝦是養(yǎng)殖對(duì)蝦三大主導(dǎo)品種之一,隨著累代養(yǎng)殖及養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化,現(xiàn)存在雜合度降低、遺傳力減弱、抗逆性差、性狀退化嚴(yán)重等不少令人堪憂的問題。為了建立對(duì)蝦高生長(zhǎng)品系或品種,本實(shí)驗(yàn)從分子生物學(xué)角度探討凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因及表達(dá)情況,從而增強(qiáng)人們對(duì)數(shù)量性狀遺傳操縱能力,提高育種中對(duì)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的準(zhǔn)確性和預(yù)見性,加速育種進(jìn)程。
　　 1凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀相關(guān)基因cDNA差減文庫構(gòu)建利用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了

2、凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀的相關(guān)基因的cDNA差減文庫,篩選并克隆出對(duì)蝦生長(zhǎng)性狀相關(guān)候選基因。經(jīng)過兩次差減雜交及二次PCR反應(yīng)。然后擴(kuò)增產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化、克隆、測(cè)序,根據(jù)斑點(diǎn)雜交的結(jié)果,獲得269個(gè)差異表達(dá)克隆,測(cè)序并搜索比對(duì)結(jié)果,獲得EST同源群(Contig)96個(gè),其中18個(gè)通過NCBIblastx同源搜索有功能注釋,為對(duì)蝦中已知基因；41個(gè)通過推測(cè)的氨基酸序列經(jīng)過blastp同源搜索到有功能注釋的蛋白,為其他物種中已知基因;31個(gè)僅在ES

3、T數(shù)據(jù)庫中搜索到同源EST序列,為凡納濱對(duì)蝦中的未知基因；6個(gè)在數(shù)據(jù)庫無同源序列,為新基因。對(duì)這些序列對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析和功能研究,將為南美白對(duì)蝦生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)理的研究提供重要線索。
　　 2凡納濱對(duì)蝦烯醇酶基因、泛素-核糖體蛋白S27a基因的克隆及生物信息學(xué)分析選取差減文庫中的烯醇酶、泛素.核糖體蛋白S27a基因測(cè)序片段,參照日本對(duì)蝦的基因序列,進(jìn)行序列延長(zhǎng)拼接。經(jīng)PCR擴(kuò)增、載體克隆、藍(lán)白斑篩選、陽性鑒定及測(cè)序?？寺》謩e得

4、到全長(zhǎng)為1364 bp的烯醇酶基因Enolase、519 bp泛素.核糖體蛋白S27a基因UBRPS27a,利用生物學(xué)軟件對(duì)該兩基因進(jìn)行了序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因蛋白疏水性、亞細(xì)胞定位、二、三級(jí)空間結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析。
　　 3凡納濱對(duì)蝦烯醇酶、泛素-核糖體蛋白S27a基因的相對(duì)定量表達(dá)分析根據(jù)凡納濱對(duì)蝦烯醇酶、泛素-核糖體蛋白S27a基因序列,設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參管家基因的定量特異引物,采用2-ΔΔCt計(jì)算方法,利用實(shí)時(shí)熒光