我國三種寄主上雙生病毒的分子鑒定及序列分析.pdf

1、雙生病毒是一類單鏈環(huán)狀DNA病毒,已在世界范圍內(nèi)的多種作物上造成嚴(yán)重危害。自20世紀(jì)90年代起,雙生病毒已在我國的云南、廣西、海南和臺(tái)灣等多個(gè)地區(qū)的作物和雜草上發(fā)生。為進(jìn)一步明確我國雙生病毒的種類分布及危害,本研究對我國云南巧家辣椒和賽葵,以及陜西番茄和四川賽葵上的雙生病毒進(jìn)行了分子鑒定。
　　 從云南巧家地區(qū)表現(xiàn)為黃化曲葉癥狀的辣椒上分離到病毒分離物YN57和YN65。DNA-A全序列分析表明,YN57和YN65DNA-A全長

2、均為2748nts,具有典型的雙生病毒科(Geminiviridae)基因組DNA-A結(jié)構(gòu)特征,共編碼6個(gè)ORFs,其中病毒鏈編碼AV1(CP)和av2共2個(gè)Orfs,互補(bǔ)鏈編碼AC1、AC2、AC3和AC4共4個(gè)ORFs;利用BLAST程序?qū)NA-A進(jìn)行分析表明,YN57DNA-A和YN65DNA-A均與云南賽葵黃脈病毒(MalvastrumyellowveinYunnanvirus,MYVYNV)Y160分離物(AJ786711.

3、1)的相似性最高,分別為82.5%和82.4%,與中國番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus,TYLCCNV)Y194分離物(AJ971265.1)次之,分別為79.7%和79.8%。而與其它雙生病毒的相似性在79.7%以下,表明YN57和YN65是雙生病毒的一個(gè)新種,暫命名為中國辣椒黃化曲葉病毒(PepperyellowleafcurlChinavirus,PYLCCNV);RDP序列重組分析表

4、明YN65DNA-A是由MYVYNV-160和TYLCCNV-Y194重組產(chǎn)生;利用雙生病毒衛(wèi)星DNAIB的通用引物beta01/beta02,從YN57和YN65中均能擴(kuò)增到DNAβ分子;序列分析表明,YN57DNAβ和YN65DNAβ均與衛(wèi)星MYVY'NB(MYVYNV伴隨的DNAβ)相似性最高,在97.0%～99.1%之間,表明巧家辣椒上分離到的PYLCCNV伴隨異源衛(wèi)星分子MYVYNB。
　　 從陜西涇陽地區(qū)的番茄上采集

5、到73份表現(xiàn)矮化、黃化和曲葉癥狀的番茄黃化曲葉病(Tomatoyellowleafcurldisease,TYLCD)樣品,利用雙生病毒簡并引物PA/PB和番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus,TYLCV)的通用引物TYT-F/TYT-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共有70個(gè)樣品檢測星陽性:利用雙生病毒DNA-B及衛(wèi)星DNA的通用引物,未擴(kuò)增到相應(yīng)目標(biāo)條帶;隨機(jī)選取樣品SX8,利用滾環(huán)擴(kuò)增PCR(RCA-PCR)、克

6、隆及測序等技術(shù)獲得病毒DNA-A的全基因組序列,該DNA-A分子全長2781nts(JN412854.1),與來自山東番茄的TYLCV-SD2(GU199587.1)的核苷酸序列相似性最高,為99.9%;系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),該病毒分離物與我國已報(bào)道的TYLCV各分離物親緣關(guān)系較近。這些結(jié)果表明,陜西番茄黃化曲葉病是由TYLCV侵染引起,該病毒可能來源于我國山東番茄上的TYLCV。
　　 為了明確云南巧家及四川米易賽葵上的雙生病毒種

7、類及復(fù)合侵染情況,基于RCA-PCR技術(shù),利用雙生病毒DNA-A、DNA-B及衛(wèi)星DNA的通用引物對31個(gè)表現(xiàn)黃脈癥狀的賽葵樣品進(jìn)行了針對WTG的檢測,從中分離到MYVYNV、TYLCCNV、MYVV等3種病毒,其中得到的4個(gè)MYVYNV分離物均與MYVYNV-Y160相似性最高,在99.3%～99.7%之間,得到的2個(gè)。TYLCCNV分離物均與TYLCNV-Y194相似性最高,分別為99.2%和99.7%,得到的1個(gè)MYVV分離物與M

8、YVV-Y206相似性最高,為99.2%。DNAβ檢測結(jié)果顯示,除YN86外,25個(gè)對WIG檢測呈陽性的樣品均伴隨有DNAβ分子,序列分析表明這些DNAβ分子可分為兩類,分別與MYVYNB-Y160(98.4%～98.7%)和MYVB-Y197(98.5%～98.7%)的序列相似性最高;未擴(kuò)增到DNA-B組分及DNAα分子。復(fù)合侵染檢測結(jié)果表明,巧家及米易地區(qū)賽葵上的復(fù)合侵染率分別為78.57%和72.72%。這些結(jié)果表明賽葵樣品中雙生