兩種雙生病毒TYLCNV和TbCSV及其衛(wèi)星DNA的分子變異.pdf

1、煙草曲莖病毒(Tobacco curly shoot virus，TbCSV)和中國番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellowleaf curl China virus，TYLCCNV)是在我國云南廣泛發(fā)生的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒，伴隨衛(wèi)星DNAβ(TbCSB和TYLCCNB)，在煙草和番茄上已造成嚴(yán)重危害。已有研究表明TbCSV/TbCSB和TYLCCNV/TYLCCNB這兩類病害復(fù)合體具有不同的致病機理。

2、衛(wèi)星TYLCCNB為輔助病毒TYLCCNV引起典型癥狀所必需的致病決定因子，且二者在田間具有緊密的伴隨關(guān)系;與之不同，TbCSB能加重TbCSV引起的癥狀但并不是其致病所必需，田間僅部分TbCSV分離物伴隨有衛(wèi)星DNAβ。為了進一步明確這兩種雙生病毒/DNAβ病害復(fù)合體在我國的發(fā)生、分布、自然寄主及變異進化規(guī)律，本文利用TbCSV和TYLCCNV的特異引物對采自我國云南、四川和廣東等8個省份的田間表現(xiàn)雙生病毒典型癥狀的11種作物及14種

3、雜革共306份樣本進行了PCR鑒定，分析了部分分離物全基因組結(jié)構(gòu)及群體遺傳多樣性，并對這兩種病毒及其伴隨衛(wèi)星種群結(jié)構(gòu)和變異進行了研究。
　　 PCR檢測結(jié)果表明，在利用雙生病毒簡并引物PA/PB檢測的306份樣本中有235份樣本呈陽性，其中有67份樣品受TYLCCNV侵染，20份樣品受TbCSV侵染，這兩種病毒的復(fù)合侵染占陽性樣品數(shù)的1.3％。在云南昭通、楚雄、保山、文山、紅河及四川攀枝花的煙草、番茄、賽葵、錦葵和勝紅薊等5種寄

4、主上檢測到TYLCCNV，TbCSV在云南德宏勝紅薊上普遍發(fā)生，另在云南的煙草、紫茉莉和四川辣椒上也檢測到該病毒，而在廣東、廣西及福建等6個省份的作物及雜草上均沒有檢測到這兩種病毒，表明TYLCCNV的分布和寄主范圍比TbCSV更廣泛。利用雙生病毒伴隨衛(wèi)星DNAβ的通用引物β01/β02進行PCR擴增發(fā)現(xiàn)，TYLCCNV分離物普遍伴隨衛(wèi)星分子，共檢測到TYLCCNB、MYVYNB及MYVB等3種衛(wèi)星DNAβ，TbCSV僅部分分離物伴隨衛(wèi)

5、星分子DNAβ，分別為TbCSB和TYLCCNB。
　　 分別選取來源于不同地區(qū)和不同寄主的6個TbCSV和23個TYLCCNV分離物及其伴隨衛(wèi)星進行全基因組測序，并對這兩種病毒的群體遺傳多樣性進行分析。結(jié)果表明，兩種病毒的自然種群均具有豐富的種群結(jié)構(gòu)，TYLCCNV的群體遺傳多樣性水平高于TbCSV，兩種病毒各區(qū)段的進化呈現(xiàn)不均衡性。利用重組分析軟件RDP3對本研究所得及GenBank中已登錄的這兩種病毒分離物序列進行重組分析

6、，結(jié)果顯示重組事件在TYLCCNV各分離物中發(fā)生較頻繁，在20個TYLCCNV分離物中共檢測到9個重組事件，其重組主要集中在IR和AC1區(qū)，在TbCSV分離物中未檢測到重組事件發(fā)生。基于TYLCCNVAV1序列，利用DnaSP對病毒種群進行中性檢測和誤配分析，對不同寄主來源或地理來源的病毒種群的歷史概況及發(fā)展動態(tài)的分析表明，TYLCCNV在云南和四川的煙草、番茄和賽葵等寄主上已形成穩(wěn)定的種群并呈擴張的趨勢。系統(tǒng)進化分析表明，對同種病毒而

7、言，其地理差異性對其進化的貢獻(xiàn)在一定程度上高于寄主差異性。
　　 本研究以TbCSV-Y35分離物(Y35A)、TYLCCNV-Y10分離物(Y10A)及其衛(wèi)星分子Y35β及Y10β為研究對象，在實驗條件下接種Y35A+Y35β及Y10A+Y10β，分析接種后不同時間段寄主本氏煙和心葉煙內(nèi)病毒的種群結(jié)構(gòu)，并比較了兩種病毒在不同寄主中的分子變異水平。結(jié)果表明Y35A在心葉煙中種群突變克隆百分率為8.33％，種群突變頻率為6.1×1

8、0-5;在本氏煙中種群突變克隆百分率和種群突變頻率分別為14.3％和1.2×10-4;而Y10A在心葉煙中種群突變克隆百分率為25.0％，種群突變頻率為2.2×10-4;本氏煙種群的突變克隆百分率為41.5％，種群突變頻率為4.3×10-4，表明TbCSV突變水平略低于TYLCCNV。為進一步明確病毒自然種群的遺傳結(jié)構(gòu)特點，分析了田間受TbCSV或TYLCCNV自然感染的寄主中的病毒群體變異，TbCSV種群突變頻率為2.8×10-4，T

9、YLCCNV種群突變頻率為6.5×10-5-4.5×10-4，與病毒實驗種群的變異水平相當(dāng)。對這兩種病毒種群變異數(shù)據(jù)的分析表明，突變在病毒的編碼區(qū)及非編碼區(qū)均有發(fā)生，且IR區(qū)變異最大;在本氏煙和心葉煙中，堿基突變類型存在差異，但均以堿基替代類型為主。兩種病毒在本氏煙中種群突變均高于心葉煙種群，表明兩種病毒在進化過程中所面臨的選擇壓力不同，寄主在病毒的進化過程中可能具有重要作用。
　　 已有研究表明衛(wèi)星DNAβ與其同源輔助病毒是共

10、進化的，為了明確衛(wèi)星DNAβ是否具有與輔助病毒相似的變異水平，本研究對這兩種衛(wèi)星即Y35β和Y10β分別伴隨同源或異源輔助病毒時在本氏煙和心葉煙中的種群結(jié)構(gòu)與突變頻率進行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與輔助病毒相比，衛(wèi)星DNAβ具有更豐富的種群遺傳結(jié)構(gòu)。伴隨同源輔助病毒時，Y35β的平均突變頻率為4.5×10-4，突變克隆百分率為43.6％;Y10β的平均突變頻率為1.5×10-3，突變克隆百分率為93.3％，表明Y10β變異水平高于Y35β。當(dāng)伴

11、隨異源輔助病毒時，Y10β所有的克隆均發(fā)生了不同程度的突變，突變克隆百分比為100％，其突變頻率為1.9×10-3，變異水平略高于其伴隨同源輔助病毒。就同種衛(wèi)星而言，變異水平在不同的寄主中存在差異。變異類型和分布特點分析表明，除堿基替代外，還檢測到大量的堿基插入與缺失，尤其是在Y10β的A-rich區(qū)888-901這一區(qū)段出現(xiàn)較多的A或G堿基的插入與缺失，而在Y35β種群內(nèi)則較多的觀察到G→T、A→C、T→A突變，堿基的插入與缺失突變比