檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的ELISA方法的建立.pdf

1、呼腸孤病毒感染可引起鴨的以頭頸腫脹、眼結(jié)膜充血（出血）、全身皮膚廣泛出血等為主要特征的傳染病，被國內(nèi)外視為危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。2010年起，我國南方地區(qū)蛋鴨中陸續(xù)發(fā)生臨床主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降的傳染性疾病，本實驗室從發(fā)病鴨群中分離、鑒定了呼腸孤病毒。為了對致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒(duck reovirus，DRV)進(jìn)行診斷和防控，本研究分別建立了檢測DRV抗原和抗體的方法，包括兩個方面:一是以大腸桿菌表達(dá)的DRVσB蛋白作為

2、包被抗原，建立檢測DRV抗體的間接ELISA方法;二是研制針對DRV的單克隆抗體，建立檢測DRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法。
　　采用RT-PCR擴(kuò)增DRV ZY/AH/1/2011株的σB基因，克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)。含有重組質(zhì)粒pET-σB的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，獲得大小為55 ku的以包涵體形式表達(dá)的重組σB蛋白。Western-blot

3、ting顯示重組σB蛋白能夠與兔抗DRV多抗血清特異性結(jié)合。以高親和NI-NTA樹脂在變性條件下純化重組σB蛋白，并用梯度尿素復(fù)性。將純化的重組σB蛋白作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中DRV抗體的間接ELISA方法。以該方法和血清中和試驗對DRV感染鴨血清和SPF鴨血清進(jìn)行檢測，兩者的符合率為100％。該方法與鴨瘟病毒、雛鴨肝炎病毒和禽流感病毒的陽性血清均無交叉反應(yīng)，批內(nèi)變異系數(shù)小于11％、批間變異系數(shù)小于14％。
　　采用差速離

4、心和蔗糖密度梯度超速離心提純DRV ZY/AH/1/2011，將其作為抗原免疫8周齡BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合。以純化的重組σB蛋白作為檢測抗原篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法亞克隆3～4次，獲得了6株穩(wěn)定分泌抗DRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，依次命名為:2D7、2D10、2B11、6B2、4D7、7H9。經(jīng)鑒定單抗效價達(dá)1∶1600～1∶51200;其中單抗2D10的亞類為IgG1、其余5株單抗的亞類為IgG

5、3;間接免疫熒光試驗顯示6株單抗與感染DRV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生特異性反應(yīng);Western-blotting顯示6株單抗能夠與重組σB蛋白特異性結(jié)合;單抗2D10與6B2、4D7可能識別不同的抗原決定簇。分別以Protein G樹脂純化的DRV兔多抗血清和2D10單抗為捕獲抗體和檢測抗體，建立了檢測DRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)方法。該檢測方法的敏感性達(dá)0.522μg/mL，與鴨瘟病毒、鴨病毒性肝炎病毒和禽流感病毒