呼腸孤病毒3型S1基因的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、呼腸孤病毒3型(reovirus type 3，Reo-3)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、正呼腸孤病毒屬(Orthoreovims)、雙鏈RNA病毒。呼腸孤病毒3型是實驗動物SPF級大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必須檢測項目。其自然感染宿主比較廣泛，如人類、小鼠、大鼠、猴、牛等，可隱性感染動物并在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，給血液制品、單克隆抗體、細胞培養(yǎng)等外來致病因子的檢定及動物試驗帶來一定的困難［4］。因此建立快速診斷方法十分必要。

2、 目前，檢測呼腸孤病毒3型主要用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測，其抗原獲得方法主要為細胞培養(yǎng)，但很難獲得高滴度的病毒；病毒雖可在雞胚內(nèi)增殖，但沒有規(guī)律性［5］。本研究利用大腸桿菌表達系統(tǒng)pQE31表達呼腸孤病毒δ1蛋白抗原部分，用純化的融合蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，可用于呼腸孤病毒血清抗體的檢測。 用生物學軟件DNAstar分析δl蛋白，根據(jù)GenBank中報道的Reo-3 S1基因序列(gi:61780)設(shè)計特異性

3、引物，用一步法RT-PCR方法擴增S1基因的主要抗原片段SR，將其插入到pMDl8-T載體中，酶切鑒定后測序。將陽性重組質(zhì)粒用Sph I+Sal I雙酶切后連接到同樣雙酶切的表達載體pQE-31上，轉(zhuǎn)化Ecoli M15(pREP-4)，IPTG誘導表達。對表達蛋白進行SDS-PAGE電泳和Westem-blot的結(jié)果表明，SR基因在E.coli M15中獲得表達，表達蛋白SR-δ1分子質(zhì)量約為32 kD，與預(yù)期大小相符，能與Reo-3

4、陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說明SR-δl有很高的抗原性。 把表達的SR-δl重組蛋白經(jīng)初步純化后用作包被抗原，建立了檢測Reo-3血清抗體的間接EIASA方法，并確定了最適抗原包被濃度(0.61μg/mL最適血清稀釋度(1:100)、血清最適作用時間(150 min)、最適封閉液(8％脫脂奶粉)、最適封閉時間(45min)、酶標抗體最適稀釋度(1:8000)、酶標二抗最適作用時間(60min)、底物最適顯色時間(10 min)和判

5、定界值(0.292)。包被的重組抗原不與EcT(鼠痘病毒)、SeV(仙臺病毒)、MHV(小鼠肝炎病毒)、PVM(小鼠肺炎病毒)陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復試驗和批間重復試驗變異系數(shù)均小于10％，說明該方法具有很好的重復性。該診斷方法與國家實驗動物檢測中心建立的ELISA檢測試劑盒比較，特異性、敏感性和符合率分別為98.5％、100％和98.7％。上述結(jié)果表明該診斷方法具有良好的特異性和敏感