鴨源呼腸孤病毒致BHK-21細胞凋亡的研究.pdf

1、本試驗采用細胞培養(yǎng)術(shù)、RT-PCR技術(shù)、光鏡、電鏡、熒光定量RT-PCR、TUNEL和流式細胞術(shù)等多種研究方法，對近幾年來湖北省鴨源呼腸孤病毒分離株(DuckReovirus，DRV) JZ061214株、HP080421株、HP081122株、HP09318株和YM101120株感染BHK-21細胞后細胞的病理變化特點、基因結(jié)構(gòu)特點、病毒增殖狀況和誘導(dǎo)細胞凋亡情況等作了系統(tǒng)的研究。
　　 DRV感染BHK-21細胞的病理變化情

2、況:攻毒后24h，細胞開始出現(xiàn)病變，表現(xiàn)為有的細胞圓縮，溶解、碎裂，攻毒48h后，病變逐漸加重，圓縮細胞越來越多，并可見懸浮的巨細胞，攻毒72h后，大量死亡細胞懸浮于培養(yǎng)液中。細胞經(jīng)H.E染色，顯微鏡觀察可見:部分細胞死亡，感染細胞核固縮、碎裂，且出現(xiàn)嗜酸性包涵體和合胞體。感染DRV的BHK-21被收集用來制作超薄切片，電鏡下可觀察到大小不一的空泡，同時，細胞質(zhì)中呈現(xiàn)晶格狀排列的病毒顆粒，病毒在細胞質(zhì)增殖、復(fù)制，通過細胞崩解釋放出來。<

3、br>　　 DRV感染BHK-21后的增殖情況:于接種病毒后1～72h七個時間段分別進行收毒，用熒光定量RT-PCR法檢測所獲病毒含量。結(jié)果表明，HP080421株、YM101120株和JZ061214株于攻毒后1～12h病毒含量較低，且呈上升趨勢;JZ061214株、HP080421株和HP09318株于攻毒后24～72h病毒含量亦呈上升趨勢;4株DRV病毒含量均于攻毒后72h達到高峰。
　　 DRV感染BHK-21細胞后流

4、式細胞儀檢測細胞凋亡情況:HP09318和HP080421凋亡高峰出現(xiàn)在攻毒后3h，YM101120的凋亡高峰在攻毒后6h，而JZ061214出現(xiàn)在12h;它們的凋亡高峰時間有所不同，但均集中在攻毒后3～12h。且隨著攻毒時間的延長，后期死亡細胞數(shù)呈增長趨勢。
　　 DRV感染BHK-21細胞后TUNEL檢測細胞凋亡結(jié)果:4株DRV均于攻毒后3h檢測到了比對照組多的凋亡陽性細胞，這些細胞的核都被染成棕黃色，隨著死亡細胞數(shù)的增加，

5、凋亡的陽性細胞數(shù)遞減。這一凋亡情況與流式細胞儀檢測的結(jié)果基本一致。
　　 DRV S組基因擴增情況:對五株DRV S2、S3和S4基因進行擴增，分別擴增出1251bp、1104bp、1104bp的片段。測序結(jié)果通過進化樹分析:五株分離株的S2基因與NP03和GZ/CHN/2007的遺傳進化關(guān)系最近，分屬同一分支，五株分離株的S3基因與GZ/CHN/2007遺傳關(guān)系最近，分屬同一分支，其中HP09318、HP081122、JZ06

6、1214、YM101120與HP080421屬同一亞系;五株分離株的S4基因與GZ/CHN/2007遺傳進化關(guān)系最近，分屬同一進化分支;五株DRV S2基因之間的同源性高達98～100％，與DRVGZ/CHN/2007株同源性高達99％，與MDRV S12株同源性高達95％，與GRV03G株同源性高達97％，與所有ARV毒株的同源性都低，范圍在77％～78％間;五株DRV S3基因之間的同源性為98～100％，與DRV NP03株同源性