基于PCR方法布魯菌疫苗株與野生菌株鑒別診斷方法的建立.pdf

1、布魯菌病(Brucellosis)是由布魯菌(Brucella)引起的一種重要人畜共患傳染病，給畜牧業(yè)和人類健康造成嚴(yán)重危害。布魯菌廣泛分布于世界各地，主要分為7個種，包括牛種布魯菌、豬種布魯菌、羊種布魯菌、沙林鼠種布魯菌、綿羊附睪種布魯菌、犬種布魯菌和海洋哺乳動物種布魯菌。弱毒疫苗免疫是布魯菌病防控的主要技術(shù)措施之一。目前，國外使用的弱毒疫苗主要是牛種布魯菌S19和RB51、羊種布魯菌Rev.1，國內(nèi)為牛種布魯菌BA19、羊種布魯菌M

2、5、豬種布魯菌S2、人布魯菌104M。盡管這些疫苗菌株的致病性已高度弱化，但仍具備對人和其它動物的感染性及一定的致病力。常規(guī)血清學(xué)方法不能嚴(yán)格區(qū)分弱毒疫苗免疫和野生菌株感染，因此弱毒疫苗免疫對布魯菌病流行病學(xué)監(jiān)測和臨床診斷帶來一些困擾?；跍?zhǔn)確進行布魯菌病診斷、流行病學(xué)監(jiān)測以及公共衛(wèi)生安全的考慮，建立可準(zhǔn)確區(qū)別布魯菌弱毒疫苗與野生菌株的檢測方法具有重大的現(xiàn)實意義。本研究根據(jù)不同布魯菌疫苗基因特性，分別建立了能夠快速鑒別豬種布魯菌疫苗株S

3、2的雙重PCR檢測方法、牛種布魯菌疫苗株BA19Cycling探針Real-timePCR檢測方法、羊種布魯菌疫苗株M5MGB探針Real-timePCR檢測方法，從而填補國內(nèi)有關(guān)這3個疫苗分子檢測技術(shù)的空白，為布魯菌病的診斷、流行病學(xué)監(jiān)測以及布魯菌疫苗的推廣應(yīng)用提供了技術(shù)保障，具有良好的應(yīng)用前景。
　　 1.豬種布魯菌疫苗株S2雙重PCR診斷方法的建立
　　 根據(jù)NCBI上發(fā)表的豬種布魯菌疫苗株S2基因序列，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)

4、，在其IclR基因上存在25bp序列缺失，以該特征性缺失片段設(shè)計特異性引物，并結(jié)合布魯菌經(jīng)典檢測方法AMOS中豬種1型特異性引物，建立了雙重PCR檢測方法。該雙重PCR方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為:同時出現(xiàn)500bp和285bp兩條帶判為疫苗株S2陽性，即疫苗株S2;其它均判為疫苗株S2陰性，即非疫苗株S2;若出現(xiàn)285bp單一條帶判為豬種布魯菌1型菌株。特異性試驗結(jié)果顯示:僅疫苗株S2檢測為陽性;而18個布魯菌種型的標(biāo)準(zhǔn)參考株、4株布魯菌疫苗株B

5、A19、S19、M5、104M和4株非布魯菌菌株基因組DNA進行PCR擴增，結(jié)果均為陰性，即非疫苗株S2。靈敏性試驗顯示，該雙重PCR方法對疫苗株S2基因組DNA的最低檢出限約為30fg，相當(dāng)于能檢測到9個細(xì)菌。用該雙重PCR方法對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存的58株布魯菌分離株基因組DNA進行檢測，結(jié)果顯示，全部菌株經(jīng)檢測均未同時出現(xiàn)兩條特異條帶，即非疫苗株S2;但是12個樣本為豬種1型菌株。對本室近年來采集的145份牛血清樣本、20份奶樣

6、本基因組DNA進行檢測，結(jié)果顯示，全部樣本檢測均未同時出現(xiàn)兩條特異條帶，即非疫苗株S2;但有11份樣本為豬種1型菌株陽性。上述試驗證明，建立的豬種布魯菌疫苗株S2分子診斷方法敏感特異、快速準(zhǔn)確，可用于豬種布魯菌疫苗株S2與野生菌株的快速鑒別檢測。
　　 2.牛種布魯菌疫苗株BA19及S19Cycling探針Real-timePCR檢測方法的建立
　　 目前，我國使用牛種布魯菌疫苗株BA19，由于BA19與S19為同源菌株

7、，利用該特點，根據(jù)Whatmore驗證的牛種布魯菌疫苗株S19上ClpX基因的SNP位點設(shè)計引物和Cycling探針，建立Real-timePCR方法。該Real-timePCR方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為:在35循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)擴增曲線，且在40循環(huán)時RFU值大于0.10，判定為出現(xiàn)典型擴增曲線，結(jié)果為布魯菌陽性;當(dāng)使用FAM標(biāo)記ClpX-P1探針檢測時，出現(xiàn)典型擴增曲線判為疫苗株BA19（或S19）陽性，即為疫苗株BA19或S19;出現(xiàn)HEX標(biāo)記Cl

8、pX-P2探針的典型擴增曲線判為非疫苗株BA19（或S19）的其它布魯菌陽性，即為非BA19（或S19）的其它布魯菌株;無任何曲線擴增時，結(jié)果為陰性，即無布魯菌。特異性試驗結(jié)果顯示:疫苗株BA19和S19按本方法檢測，可鑒定為疫苗株BA19或S19陽性;18個布魯菌種型的標(biāo)準(zhǔn)參考株、3株布魯菌疫苗株S2、M5、104M，按本方法鑒定為非BA19（或S19）的其它布魯菌株陽性，CT值集中在11.21-25.62之間;4株非布魯菌菌株結(jié)果為

9、陰性，表明該方法特異性良好。以疫苗株BA19基因組DNA做10倍遞進稀釋，進行靈敏性試驗，結(jié)果該方法的最低檢出限約為60fg基因組DNA，相當(dāng)于能檢測到18個細(xì)菌。選擇10-3～10-5三個稀釋度分別進行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示三個稀釋度CT值的變異系數(shù)均小于1％，表明本方法重復(fù)性良好。對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存提供的58株布魯菌分離株進行Real-timePCR檢測，結(jié)果顯示，全部樣本均鑒定為非疫苗株BA19（或S19）的其它布魯菌。對近年

10、來從我國部分布魯菌病疫區(qū)牛群中采集的臨床血清樣本125份，用Real-timePCR方法檢測。結(jié)果顯示，其中39份樣本為疫苗株BA19（或S19）陽性，81份樣本為非疫苗株BA19（或S19）的其它布魯菌;5個樣本無任何擴增曲線出現(xiàn)，結(jié)果為陰性。來自另5個牛場且未進行過布魯菌疫苗免疫的20份血清樣本和20份奶樣本檢測結(jié)果均為非疫苗株BA19（或S19）的其它布魯菌。上述試驗證明，建立的BA19及S19疫苗株Cycling探針Real-t

11、imePCR檢測方法，具備了檢測速度快、靈敏度高、特異性強、重復(fù)性好的特點，可用于我國牛種布魯菌疫苗BA19免疫與野生菌株感染的鑒別檢測。
　　 3.羊種布魯菌疫苗株M5以及母源株M28MGB探針Real-timePCR檢測方法的建立
　　 根據(jù)NCBI上發(fā)表的羊種布魯菌疫苗株M5（母源株M28）基因組序列，經(jīng)比對，選擇glycosyltransferase基因上SNP位點設(shè)計引物和MGB探針，建立Real-timePC

12、R方法。該Real-timePCR方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為:在35循環(huán)內(nèi)出現(xiàn)擴增曲線，且在40循環(huán)時RFU值大于0.03，判定為出現(xiàn)典型擴增曲線，結(jié)果為布魯菌陽性;當(dāng)使用VIC標(biāo)記M5G探針檢測時，出現(xiàn)典型擴增曲線判為疫苗株M5（或M28）陽性，即為疫苗株M5或母源株M28;當(dāng)使用FAM標(biāo)記M5A探針檢測時，出現(xiàn)典型擴增曲線判為非疫苗株M5（或M28）其它布魯菌株陽性，即為非疫苗株M5（或M28）的其它布魯菌株;無任何曲線擴增時，結(jié)果為陰性，即

13、無布魯菌。特異性試驗結(jié)果顯示:疫苗株M5按本方法檢測，結(jié)果為疫苗株M5陽性;18個布魯菌種型的標(biāo)準(zhǔn)參考株、4株布魯菌疫苗株S2、BA19、S19、104M，按本方法鑒定為非疫苗株M5（或M28）的其它布魯菌株，CT值在13.03-28.06之間;4株非布魯菌菌株結(jié)果為陰性，表明本方法特異性良好。以疫苗株M5基因組DNA做10倍遞進稀釋，進行靈敏性試驗，結(jié)果顯示本方法的最低檢出限約為300fg基因組DNA，相當(dāng)于能檢測到90個細(xì)菌。選擇1

14、0-1～10-3三個稀釋度分別進行重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示三個稀釋度CT值的變異系數(shù)均小于1％，表明本方法重復(fù)性良好。對中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存提供的58株布魯菌分離株進行Real-timePCR檢測，結(jié)果顯示，其中4份可能為疫苗株M5或母源株M28;54份為非疫苗株M5（或M28）的其它布魯菌。對近年來從我國部分布魯菌病疫區(qū)牛群中采集的臨床血清樣本125份，用Real-timePCR方法檢測。結(jié)果顯示，其中15份樣本為疫苗株M5或母源株M2