TolC在腸外致病性大腸桿菌中的生物學(xué)功能研究.pdf

1、腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic Escherichia coli，ExPEC)是一類人獸共患病病原菌，感染后可以引起人和動物的一系列臨床癥狀。其中典型的腸外感染包括尿道、生殖道感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、循環(huán)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)感染，并且感染數(shù)量逐年上升，增加了醫(yī)療成本，動物生產(chǎn)力下降，給社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔(dān)。細菌多重耐藥性和生物被膜的形成，以及缺乏有效保護的疫苗，均使ExPEC的防控更加困難。

2、>　　在許多革蘭氏陰性菌細胞膜中，均發(fā)現(xiàn)有多藥抗性外排系統(tǒng)的存在，與臨床細菌多重耐藥性相關(guān)。多藥抗性外排泵(Multidrug-resistance efflux pumps)由三組分構(gòu)成:位于細胞膜內(nèi)膜上的轉(zhuǎn)運蛋白、位于周質(zhì)間隙中的輔助蛋白、位于細胞膜外膜上的外膜蛋白，三者形成一個三聚體，由質(zhì)子泵勢能供能而發(fā)揮作用。耐大腸菌素TolC(Tolerant colicin)外膜蛋白是組成革蘭氏陰性菌多藥抗性外排泵的最重要的組成成分，參與許

3、多不同家族外排泵的形成，介導(dǎo)多重耐藥性的產(chǎn)生。近年來有研究表明TolC蛋白參與細菌的毒力和生物被膜的形成，并可參與細菌自身代謝產(chǎn)生的生物小分子和大分子物質(zhì)的泵出。然而TolC在ExPEC中的生物學(xué)功能目前尚不清楚。
　　本研究以豬源ExPEC PPECC42株為研究對象，通過構(gòu)建tolC基因缺失株及其回復(fù)補償株，系統(tǒng)探索外排泵蛋白TolC在ExPEC的生物被膜形成、致病性以及抵抗高滲環(huán)境中的作用，主要研究結(jié)果如下:
　　1.

4、TolC缺失對ExPEC生物被膜形成的影響以豬源ExPEC作為親本株(WT)，利用同源重組技術(shù)構(gòu)建tolC基因缺失突變株(ΔtolC)及其回補株（Cm-tolC），并對其生物被膜形成能力進行評價。結(jié)果顯示，在28℃培養(yǎng)條件下，在M9培養(yǎng)基中WT株和回補株均具有強生物被膜形成能力，而△tolC喪失了生物被膜形成能力。通過掃描電子顯微鏡對細菌表面結(jié)構(gòu)進行觀察發(fā)現(xiàn)，在M9培養(yǎng)基28℃條件下，WT菌株大量堆積、互相黏結(jié)作用、并且細菌表面具有大量

5、的絲狀菌毛樣物質(zhì)存在;而ΔtolC均以散在或單個存在在蓋玻片上。curli菌毛和纖維素是大腸桿菌生物被膜形成過程中最為主要的兩種胞外基質(zhì)，通過剛果紅染色法和熒光白染色法試驗證實在M9培養(yǎng)基中28℃條件下，ΔtolC喪失了curli菌毛的生物合成能力，而纖維素合成能力增強。為進一步對ΔtolC的curli菌毛和纖維素的生物合成能力改變進行驗證，采用qRT-PCR對curli菌毛合成基因csgB和csgD以及纖維素合成酶基因bcsA進行定量

6、測定，結(jié)果顯示在M9培養(yǎng)基28℃下，ΔtolC的csgB和csgD基因的表達量與WT株相比均顯著下降(p＜0.01)，而bcsA基因的表達量在生物被膜形成后期顯著升高(p＜0.01)。
　　為探索TolC在ExPEC生物被膜形成以及胞外基質(zhì)成分的生物合成中的作用與培養(yǎng)基滲透壓之間的關(guān)系，本研究比較WT菌株和ΔtolC株在28℃下1/2 M9培養(yǎng)基中（一種低滲培養(yǎng)基）的生物被膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔtolC的生物被膜形成能力得到恢復(fù)，

7、并且為強生物被膜菌株，curli菌毛和纖維素的生物合成能力也恢復(fù)到WT菌株的水平，csgB/csgD和bcsA基因的表達在生物被膜形成中后期也恢復(fù)到WT菌株的水平。進一步研究表明，在1/2M9培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl和蔗糖增加培養(yǎng)基滲透壓后，WT菌株和ΔtolC株生物被膜形成能力均受到抑制;但與WT菌株相比，ΔtolC株的生物被膜形成能力對滲透壓的變化更為敏感。此外，通過TRANS-WELL試驗證實，ΔtolC株造成生物被膜形成能

8、力差異過程中沒有生物被膜形成相關(guān)信號小分子物質(zhì)的參與;通過超薄切片和透射電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)ΔtolC株與WT菌株相比，外膜結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)生改變。因此，TolC缺失導(dǎo)致ExPEC失去生物被膜形成能力，能使細菌外膜完整性發(fā)生改變，菌體表面正常的菌毛成分減少，降低了細菌對外界環(huán)境滲透壓的適應(yīng)能力。
　　2.TolC缺失對ExPEC致病性的影響本研究采用體內(nèi)和體外試驗的方法評價tolC缺失對ExPEC毒力的影響。通過體內(nèi)腹腔感染小鼠試驗，

9、結(jié)果表明△tolC株的毒力與WT菌株相比顯著下降;補償株的毒力得到恢復(fù)，證實tolC基因缺失可降低ExPEC的毒力和致病性。通過剛果紅平板證實WT菌株可以形成curli菌毛，而tolC和csgD缺失菌株均不能生物合成curli菌毛。此外細菌對肺上皮細胞和巨噬細胞粘附侵襲實驗表明，ΔtolC株對細胞的黏附和侵襲能力均顯著下降，其中ΔtolC株的黏附和侵襲能力與csgD缺失株相當。在巨噬細胞存活試驗中，與WT菌株相比在巨噬細胞中存活的早中期

10、，ΔtolC株和ΔcsgD株的存活能力相當，與WT菌株相比均顯著下降。由于curli菌毛對細菌黏附和侵襲宿主細胞以及定植中發(fā)揮著重要作用，因此這些結(jié)果表明:ΔtolC株對細胞的黏附和侵襲能力的下降以及在巨噬細胞中存活能力的下降的原因是或部分是ΔtolC株curli菌毛合成能力喪失導(dǎo)致。對剛死亡的小鼠進行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與WT菌株感染相比，感染ΔtolC株死亡的小鼠其大部分內(nèi)臟器官的組織損傷程度均較小，組織中細菌團塊也較少。因此，體外

11、和體內(nèi)試驗均證實TolC參與了ExPEC的致病性，并且ΔtolC株的致病性下降可能是由于curli菌毛生物合成能力的喪失引起。此外，還通過2D電泳和質(zhì)譜技術(shù)對WT菌株和tolC缺失菌株的膜蛋白質(zhì)組學(xué)進行比較，分析tolC缺失對膜蛋白成分表達的影響，結(jié)果表明細菌膜蛋白中具有的差異蛋白分別為代謝酶類、調(diào)控蛋白以及毒力相關(guān)蛋白。根據(jù)上述研究結(jié)果，推測ΔtolC株對小鼠致病力下降可能是其在機體內(nèi)定植和繁殖能力下降所致，導(dǎo)致這種下降作用可能是由于

12、ΔtolC株的curli菌毛生物合成能力喪失以及引起細菌膜蛋白差異表達造成。
　　3.TolC缺失對ExPEC在高滲環(huán)境下存活能力的影響本部分研究表明在含不同濃度的NaCl或蔗糖的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，與WT菌株相比，ΔtolC株在不同高滲培養(yǎng)基中的生長受到顯著性的抑制，在培養(yǎng)24h后ΔtolC株與野生株相比，活菌數(shù)顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。此外，在高滲的NaCl或蔗糖溶液中，ΔtolC株活菌數(shù)也同樣顯著下降(P＜0.

13、05或P＜0.01)，并且這種下降呈時間依賴性。因此表明ExPEC的ΔtolC株在NaCl或蔗糖形成的高滲溶液中，其生長作用或存活能力顯著下降，證實TolC蛋白在ExPEC抵抗高滲環(huán)境中發(fā)揮著最基本的作用。由于外排泵蛋白TolC能夠降低ExPEC在高滲環(huán)境中的存活能力，因此這種現(xiàn)象在食品工業(yè)中是非常有意義和價值的。為更進一步的研究外排泵抑制劑(efflux pumps inhibitors，EPIs)在高滲條件下對ExPEC存活的影響，

14、在外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)聯(lián)合高滲環(huán)境下測定ExPEC WT菌株的存活能力。當培養(yǎng)基或溶液中添加12.5μtg/ml CCCP后，WT菌株在不同的高滲溶液中與不加CCCP的相比，其存活能力顯著下降。此外，添加CCCP后還可以抑制ExPEC的生物被膜形成，說明CCCP對于ExPEC生物被膜的形成具有有效的清除作用。由于EPIs可以加強高滲環(huán)境下對細菌的殺滅和抑制作用以及抑制生物被膜的形成，因此，EPI在食品工業(yè)中可能會成為一種