禽致病性大腸桿菌E058株在雞感染模型中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及sodA基因功能和致病性評(píng)價(jià).pdf

1、致病性大腸桿菌可以分為腸道內(nèi)致病性大腸桿菌(intestinal pathogenic Escherichiacoli)和腸道外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenic E.coli，ExPEC)兩類。禽致病性大腸桿菌(avian pathogenic Escherichia coli，APEC)屬于ExPEC中的一種，可以通過(guò)呼吸道途徑感染禽類從而引起多系統(tǒng)損傷綜合征。該病給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成

2、為危害養(yǎng)禽業(yè)的重要細(xì)菌病之一，因此，如何防控該病成為養(yǎng)禽業(yè)面臨的一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。此外，APEC與引起人類尿道感染的尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)具有很大的相似性，因而APEC目前也被認(rèn)為是一種食源性的病原菌，具有重要的公共衛(wèi)生意義。
　　DNA芯片是一種穩(wěn)定、實(shí)用、可行的全基因組分析方法，能夠探索病原體的分子致病機(jī)制，還可以分析細(xì)菌病原體在與宿主相互作用時(shí)的全局基因表達(dá)模式，有助于識(shí)別毒力

3、因子及其對(duì)應(yīng)的調(diào)控機(jī)制。本研究選取APEC O2血清型代表性菌株E058為模式菌株，利用DNA芯片研究其在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)潛在的毒力基因進(jìn)行研究，擬通過(guò)本研究弄清APEC在感染宿主體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜，并進(jìn)一步挖掘潛在的毒力基因，為揭示APEC的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。
　　1.基于DNA芯片分析APEC E058株在感染雞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜
　　本研究選擇代表性的APEC分離株E058，

4、感染1日齡無(wú)特定病原體（specificpathogenfree，SPF）雞，從感染雞血液中收集菌體，并以E058株在體外LB培養(yǎng)條件下的菌體作對(duì)照，以包含UPEC代表性菌株CFT073以及非致病性菌株K12全基因組序列的商品化DNA芯片(Affymetrix GeneChip(R) E.coli Genome2.0 Array)，在全基因組范圍內(nèi)，測(cè)定APEC E058株在感染雞體內(nèi)、外基因的表達(dá)水平，從而揭示APEC在感染宿主體內(nèi)的

5、基因表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，APEC E058株在感染雞體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)的基因共有245個(gè)，顯著下調(diào)基因共有369個(gè)，差異表達(dá)基因主要涉及細(xì)菌生理代謝、鐵攝取轉(zhuǎn)運(yùn)、毒力、壓力應(yīng)激和生物學(xué)調(diào)控等方面。根據(jù)基因芯片分析結(jié)果選取了12個(gè)差異表達(dá)基因（8個(gè)上調(diào)和4個(gè)下調(diào)基因）經(jīng)熒光定量PCR分析來(lái)驗(yàn)證芯片分析獲得的數(shù)據(jù)，結(jié)果表明熒光定量PCR確定所選基因的表達(dá)水平與基因芯片的結(jié)果一致，由此可以確定基因芯片結(jié)果的可靠性。同時(shí)，依據(jù)芯片結(jié)果，篩選APE

6、C E058株在體內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)的基因jiY, sodA，phoB和spy，運(yùn)用基因敲除技術(shù)進(jìn)行缺失突變，通過(guò)比較親本株和突變株對(duì)1日齡雛雞的致病力，初步了解和推測(cè)所選基因?qū)χ虏⌒苑矫娴挠绊?。結(jié)果顯示，APEC E058的毒力并未因yjiY, phoB和spy基因的缺失而下降，但是sodA缺失后，APECE058對(duì)雛雞的致病力顯著下降，表明sodA可能作為潛在的毒力基因參與APEC的致病進(jìn)程，接下來(lái)進(jìn)一步對(duì)sodA基因的功能和致病力進(jìn)行

7、評(píng)價(jià)。該研究對(duì)于明確目標(biāo)基因在體內(nèi)的表達(dá)水平與其致病作用間的關(guān)系，即在體內(nèi)表達(dá)水平明顯上調(diào)的基因是否為真正毒力基因提供依據(jù)。
　　2.禽致病性大腸桿菌sodA突變株的構(gòu)建及其致病性研究
　　超氧化物歧化酶SodA作為一種抗氧化應(yīng)激因子，在細(xì)菌抗吞噬細(xì)胞的氧化效應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。它對(duì)于APEC毒力的直接影響至今還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在研究抗氧化相關(guān)基因sodA與APEC致病性之間的關(guān)系，為揭示APEC的致病機(jī)理及進(jìn)一步構(gòu)建AP

8、EC弱毒疫苗株奠定基礎(chǔ)。本文運(yùn)用λRed重組系統(tǒng)構(gòu)建E058ΔsodA基因缺失突變株，之后將帶有相應(yīng)啟動(dòng)子的sodA基因完整閱讀框插入到低拷貝質(zhì)粒pACYC184中，通過(guò)電轉(zhuǎn)化突變株來(lái)篩選獲得回復(fù)株。生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，突變株生長(zhǎng)速度與野生株E058相似，并未表現(xiàn)出明顯差異，但在含H2O2的LB培養(yǎng)基中，E058ΔsodA突變株的生長(zhǎng)速度顯著低于野生株;體外競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，在LB培養(yǎng)基中，突變株表現(xiàn)為輕度致弱;血清

9、殺菌試驗(yàn)表明突變株和野生株對(duì)SPF雞血清殺菌作用不敏感;菌株生物被膜檢測(cè)結(jié)果顯示突變株的被膜形成能力與野生株相當(dāng);體外模擬體內(nèi)環(huán)境應(yīng)激條件下的細(xì)菌存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株對(duì)H2O2比較敏感，而對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高滲透壓、尿素等環(huán)境均不敏感;雞巨噬細(xì)胞HD-11細(xì)胞吞噬與胞內(nèi)細(xì)菌增殖試驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株E058ΔsodA對(duì)HD-11細(xì)胞抗吞入和定植能力均下降;半數(shù)致死量實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株的致病力下降約100倍;3