六型分泌系統(tǒng)在豬源腸外致病性大腸桿菌引起宿主天然免疫過程中的作用研究.pdf

1、革蘭氏陰性菌已經(jīng)進化出多種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，以輸出或輸入跨膜大分子來適應環(huán)境和存活。2006年，Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥSecretion System，T6SS)首次在銅綠假單胞菌和霍亂弧菌中作為新型的細菌蛋白分泌系統(tǒng)被定義，并證明其與致病性有關且介導致病菌與宿主的相互作用。T6SS廣泛存在于約四分之一的革蘭氏陰性菌中，是一種多功能的注射裝置，可以將效應分子傳遞至環(huán)境、真核宿主和原核競爭者。T6SS由跨膜復合物和類似噬菌體尾鞘的針管狀結

2、構組成。關于T6SS的結構研究中，普遍認為Hcp是T6SS的關鍵結構組分，以頭對頭或頭對尾的方式聚合形成環(huán)狀六聚體從而形成T6SS的內(nèi)管道，在鞘收縮時推動T6SS靶向細胞以輸送效應蛋白。作為T6SS結構重要組成部分的同時，Hcp的分泌作為T6SS發(fā)揮功能的標志。
　　有關細菌分泌系統(tǒng)的結構和機制研究已取得重大進展。近年來，關于分泌系統(tǒng)在宿主一致病菌的互作中尤其是關于免疫應答的復雜作用己成為研究熱點。細菌分泌系統(tǒng)傳送效應分子來干擾宿

3、主細胞的正常生理功能，以一定的方式影響炎性小體通路。本研究中，PCN033是分離于病豬的腸外致病性大腸桿菌，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大腸桿菌一樣，PCN033的基因組中有3個hcp拷貝，其中兩個位于T6SS基因簇內(nèi)，另一個位于T6SS基因簇外，分別命名為hcp1、hcp2、hcp3。本實驗室已構建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株，hcp作為T6SS發(fā)揮功能的標志，缺失hcp后，T6SS無法正

4、常組裝進而發(fā)揮作用，故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3兩個菌株，對PCN033感染后的宿主應答及T6SS在激活炎癥過程中發(fā)揮的作用進行了探究，主要內(nèi)容如下:
　　1.RNA-seq檢測PCN033感染后RAW264.7的轉錄組變化
　　選擇小鼠巨噬細胞RAW264.7為PCN033的宿主細胞模型，對感染PCN033后宿主細胞RAW264.7內(nèi)發(fā)生的轉錄組變化進行分析，發(fā)現(xiàn)了508個差異表達的基因，對差異

5、基因進行功能分析，發(fā)現(xiàn)在GO數(shù)據(jù)庫中，與之相關且有統(tǒng)計學意義的涉及2052項生物過程、133種細胞組分、211個分子功能及52種KEGG代謝通路。差異基因參與的KEGG代謝通路中與天然免疫相關的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信號通路。
　　2.PCN033激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體
　　通過Western-blot檢測PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信號通

6、路的激活情況和胞內(nèi)蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表達情況。結果表明，隨著感染時間增加，p65發(fā)生磷酸化、IκBα降解，NLRP3、NLRC4及ASC的表達均明顯上調(diào)。這說明，PCN033感染后激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體。
　　3.T6SS在PCN033與宿主互作過程中的作用
　　有文獻報道T6SS能夠促進小鼠巨噬細胞的細胞毒性作用。對細胞培養(yǎng)液中的LDH進行檢測，發(fā)現(xiàn)Δhcp1Δhcp2Δh

7、cp3感染相對于PCN033感染后的細胞毒性顯著降低，表明了T6SS對小鼠巨噬細胞的細胞毒性作用有促進作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同樣的劑量靜脈注射小鼠后，通過ELISA測定小鼠血清中的IL-1β。發(fā)現(xiàn)相對于野毒株PCN033，缺失hcp后感染使得小鼠產(chǎn)生IL-1β的能力減弱，也就是說T6SS以一定的方式參與PCN033促進IL-1β的釋放。進一步，我們對炎性因子的轉錄水平進行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)T6SS對促