腸外致病性大腸桿菌基因缺失突變株ΔhmuU,ΔhmuV,ΔhmuU-ΔhmuV的構(gòu)建.pdf

1、大腸桿菌（Escherichiacoli，E.eoli）是一類(lèi)在自然界中存在范圍廣，血清型復(fù)雜，致病性多樣的重要的人畜共患病原菌。根據(jù)遺傳和致病特點(diǎn)，可將大腸桿菌分為以下3種類(lèi)群:共生菌群，致腹瀉型菌群和腸外致病性菌群。腸外致病性大腸桿菌(ExtraintestinalPathogenicEscherichiacoli，ExPEC)是指一群能在腸道中定殖不引起腹瀉但能引起腸外組織感染的一類(lèi)大腸桿菌。ExPEC因其特異性的毒力因子而引起人

2、和動(dòng)物特定的疾病，包括:人新生兒腦膜炎，泌尿道感染，豬的肺炎、腎炎、腦膜炎、敗血癥等，禽的氣囊炎、滑膜炎、腹膜炎、敗血癥等。
　　 鐵是大腸桿菌生存必需的一種重要的營(yíng)養(yǎng)元素，許多代謝活動(dòng)都需要鐵的參與。血紅素(heme)是大腸桿菌主要的鐵源之一，heme的攝取能力直接關(guān)系到大腸桿菌在宿主體內(nèi)生存代謝的能力。由heme載體介導(dǎo)的heme攝取途徑是heme的一種重要吸收方式，hmuU基因和hmuV基因是參與該途徑的重要基因，而通過(guò)比

3、較本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)測(cè)序的5株豬源腸外致病性大腸桿菌強(qiáng)弱毒株間heme攝取系統(tǒng)的差異基因發(fā)現(xiàn)hmuU基因和hmuV基因在強(qiáng)弱毒株間存在差異，推測(cè)hmuU基因和hmuV基因可能在大腸桿菌的毒力和致病性方面有功能。因此本研究以大腸桿菌強(qiáng)毒株P(guān)CN033為親本菌，構(gòu)建了3株腸外致病性大腸桿菌PCN033株的基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV，并對(duì)其生物學(xué)特性及小鼠毒力進(jìn)行了研究。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 1.腸外致

4、病性大腸桿菌PCN033株基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的構(gòu)建與鑒定
　　 以PCN033株基因組為模板，擴(kuò)增hmuU基因和hmuV基因的上下游同源臂，擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到自殺性質(zhì)粒pRE112上構(gòu)建重組質(zhì)粒pREΔhmuU、pREΔhmuV和pREΔhmu。分別將重組自殺性質(zhì)粒pREΔhmuU和pREΔhmuV轉(zhuǎn)化大腸桿菌X7213，與PCN033株進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，經(jīng)過(guò)兩次單交換篩選出單基因缺失突變株

5、ΔhmuU和ΔhmuV。雙基因缺失突變株是在單基因缺失突變株ΔhmuV的基礎(chǔ)上篩選，方法相同。
　　 2.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的遺傳穩(wěn)性和生長(zhǎng)特性研究
　　 分別將構(gòu)建的基因缺失突變株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)20代，每隔5代進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果證明基因缺失突變株在20代內(nèi)均能夠穩(wěn)定遺傳。在普通LB培養(yǎng)基（全營(yíng)養(yǎng)條件）和鐵營(yíng)養(yǎng)限制條件下測(cè)定3株基因缺失株與親本菌株的生長(zhǎng)曲線，得出在全營(yíng)養(yǎng)時(shí)

6、3株基因缺失突變株與親本株生長(zhǎng)速度相似，在鐵營(yíng)養(yǎng)限制條件時(shí)，3株基因缺失突變株的生長(zhǎng)速率低于親本株，其中兩株單基因缺失突變株生長(zhǎng)速度較慢，雙基因缺失突變株生長(zhǎng)速度最慢。
　　 3.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV的細(xì)胞粘附與侵入及抗吞噬試驗(yàn)
　　 腸外致病性大腸桿菌PCN033株基因缺失突變株ΔhmuU、ΔhmuV、ΔhmuU/ΔhmuV和親本菌株分別與PAM細(xì)胞、RAW細(xì)胞和PK15細(xì)胞共培

7、養(yǎng)，并在培養(yǎng)后不同時(shí)間用壯觀霉素和氯霉素處理，然后收集細(xì)胞并裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)菌平板計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞吞噬菌量或侵入菌量。每個(gè)樣品重復(fù)四次。對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3株基因缺失突變株與親本菌株間的吞噬菌量和粘附與侵入菌量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示3h時(shí)，PAM細(xì)胞抗吞噬能力試驗(yàn)，3株基因缺失突變株與親本菌株差異極顯著(P＜0.01);RAW細(xì)胞抗吞噬能力試驗(yàn)，3株基因缺失突變株與親本菌株間差異顯著(P＜0.05)。粘附與侵入能力試驗(yàn)，3株基因缺失突變株的能

8、力比親本株有所減弱，但差異分析不顯著(P＞0.05)。
　　 4.基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV對(duì)小鼠的感染試驗(yàn)
　　 將3種基因缺失突變株ΔhmuU，ΔhmuV與ΔhmuU/ΔhmuV分別用5.0×105CFU、5.0×106CFU、5.0×107CFU三個(gè)不同劑量腹腔注射感染各組小鼠，每小組5只小鼠使用一個(gè)感染劑量。并設(shè)一組為親本菌株P(guān)CN033對(duì)照。感染后連續(xù)觀察1周，記錄各組小鼠死亡

9、情況，根據(jù)寇氏(Korbor)法計(jì)算每個(gè)菌株的小鼠半數(shù)致死劑量(LD50)。結(jié)果顯示兩株單基因缺失株的LD50值為1.5×106CFU，雙基因缺失株的LD50值為1.5×107CFU，親本菌株的LD50值為9.5×105CFU。與親本菌株相比，單基因缺失突變株毒力下降約2倍，雙基因缺失突變株毒力下降約16倍。
　　 將攻毒后12h內(nèi)死亡的小鼠無(wú)菌解剖，分別采集肝，心，脾，肺，腎，腦等組織，稱量，研磨后稀釋涂平板計(jì)數(shù)，計(jì)算各組織載