團頭魴缺氧應(yīng)答相關(guān)基因的分子調(diào)控機制的研究.pdf

1、團頭魴(Megalobrama amblycephala)屬不耐低氧的鯉科魚類。在大規(guī)模經(jīng)濟養(yǎng)殖中極易缺氧,成為限制其產(chǎn)量的主因素。在動物耐受低氧的生理應(yīng)答的分子機制中,一系列氧敏感基因的轉(zhuǎn)錄、調(diào)控諸如物質(zhì)和能量代謝、血管生成以及細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程,從而維持機體在缺氧狀態(tài)下的存活。目前脊椎動物中已發(fā)現(xiàn)IGFBP-1(胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1)和EPO(促紅細(xì)胞生成素)對低氧環(huán)境非常敏感;在經(jīng)濟魚類中,它們分子水平上的研究非常有限

2、,例如結(jié)構(gòu)、表達特征的調(diào)控機制。通過克隆團頭魴IGFBP-1及EPOcDNA全長,分析其結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)控因素,對解釋團頭魴不耐低氧的分子機制和耐低氧團頭魴良種的選育有著重要的研究意義。
　　本研究一方面通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆獲得了團頭魴IGFBP-1和EPO的cDNA全長序列,分別為1135bp和903bp,其ORF開放閱讀框分別為789bp和552bp,可編碼262和183個氨基酸殘基。通過信息學(xué)軟件分析表明,團頭

3、魴IGFBP-1的N端(含典型IGFBP蛋白家族基序)及C端(含一個甲狀腺球蛋白結(jié)合位點)結(jié)構(gòu)域具有較高的保守性。團頭魴 EPO蛋白分子中有三個 N-連接和一個 O-連接糖基化位點;N端含有與EPO分子成熟相關(guān)的信號前肽。
　　通過半定量RT-PCR檢測,分析了團頭魴胚胎和成魚各組織中IGFBP-1及EPO mRNA的時空表達。在常氧狀態(tài)下,團頭魴IGFBP-1表達量隨著胚胎發(fā)育過程逐漸增加;EPO在整個胚胎發(fā)育時期表達量均較為恒

4、定,無明顯差異,進一步經(jīng)整胚原位雜交探針檢測結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相一致,空間上EPOmRNA主要在胚胎的前、中、后腦表達。在團頭魴成魚不同組織中,所有被檢測組織中 IGFBP-1均有mRNA表達,其中以肝臟、腸和心臟中表達水平較高。而EPO mRNA在除肝、腦和心臟以外的其他組織中均未檢測到。缺氧(溶氧值約1.0mg/l)4h后,IGFBP-1 mRNA水平在皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、腸、和心臟中分別為對照組的23.3、21.0、32.

5、7、26.1、19.0和32.0倍;恢復(fù)水中溶氧24h后,各個組織中IGFBP-1轉(zhuǎn)錄水平均恢復(fù)到正常組水平。缺氧(溶氧值約1.0mg/l)4h后,EPO在腦、肝和心臟中的轉(zhuǎn)錄水平有顯著變化,分別為對照組的19.8、20.1和39.4倍;并且腎臟組織中出現(xiàn)微量表達。平行實驗組恢復(fù)水中溶氧24h后，EPO表達量在所檢測的組織中均降至正常組水平;腎臟組織中幾乎檢測不到EPO mRNA。研究結(jié)果推測團頭魴IGFBP-1和EPO在團頭魴缺氧應(yīng)答

6、過程中發(fā)揮了重要的作用。本研究為探索團頭魴在缺氧環(huán)境中分子水平的調(diào)控機制提供了一定的實驗依據(jù)。
　　在碩士論文研究階段,還對金魚不同品系Tgf2轉(zhuǎn)座子的側(cè)翼序列及拷貝數(shù)進行了擴增及鑒定,建立一種可檢測Tgf2轉(zhuǎn)座子在金魚基因組插入拷貝數(shù)和側(cè)翼序列的接頭反向新方法。在金魚(Carassius auratus)的珍珠品系中尋找具有天然有活性的Tgf2轉(zhuǎn)座子的個體,獲得了珍珠Tgf2轉(zhuǎn)座子兩端的側(cè)翼DNA序列;發(fā)現(xiàn)在左臂末端和右臂末端有