雜合抗菌肽LFM-3的分子設(shè)計(jì)及其在畢赤酵母中的表達(dá).pdf

1、隨著抗生素的過度使用，一方面導(dǎo)致食品中的藥物殘留問題間接危害人們的身體健康;另一方面又給病原菌造成巨大選擇壓力，導(dǎo)致出現(xiàn)許多抗生素抗性的菌株，直接威脅人們的身體健康?？咕氖巧矬w在進(jìn)化過程中最早產(chǎn)生的免疫活性分子之一，是動(dòng)物先天性免疫應(yīng)答中極其古老的成分，在動(dòng)物先天性防御體系中占據(jù)重要地位?？咕姆肿佑?0～100個(gè)氨基酸殘基組成，廣泛存在于動(dòng)植物與微生物中，具有廣譜抗菌、不易產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)?？咕某司哂锌辜?xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、抗

2、寄生蟲的功能，還具有免疫調(diào)節(jié)、參與細(xì)胞信號傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖等功能。因此，抗菌肽在臨床醫(yī)療中以及動(dòng)物保健中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而天然抗菌肽并非完美無缺，與抗生素相比，抗菌譜相對較窄、合成成本較高、部分對病原微生物有殺滅活性的同時(shí)對真核細(xì)胞存在溶血作用。對抗菌肽分子進(jìn)行設(shè)計(jì)與改造，開發(fā)出高抗菌活性低溶血性的抗菌肽意義重大。
　　 盡管抗菌肽的分子設(shè)計(jì)還存在許多困難，但是運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)方法，計(jì)算抗菌肽的結(jié)構(gòu)參數(shù)，分析這些結(jié)構(gòu)參

3、數(shù)對抗菌肽活性的影響，進(jìn)而篩選出更優(yōu)秀的抗菌肽仍然是可能的。運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)工具，將不同抗菌肽分子的核心序列進(jìn)行雜合，就是獲得更優(yōu)秀的抗菌肽分子的最為有效的方法之一。
　　 本研究選取牛乳鐵蛋白肽與Magainin-2的核心功能序列，進(jìn)行不同片段間的雜合，得到6條α-螺旋型雜合抗菌肽。利用眾多的生物信息學(xué)工具，計(jì)算它們的理化結(jié)構(gòu)參數(shù)，比較雜合抗菌肽的凈正電荷數(shù)多少、疏水力大小以及兩親性強(qiáng)弱，分析它們的二級結(jié)構(gòu)，比較它們的螺旋度

4、，繪制螺旋輪圖譜驗(yàn)分析雜合肽的兩親性與電荷分布特征。將雜合肽的氨基酸序列送往公司合成后，檢測合成肽最小抑菌濃度以及溶血性。結(jié)果顯示，合成雜合抗菌肽LFM-3的抑菌效果最佳，對革蘭陽性的金黃色葡萄球菌CowanⅠ的MIC為16μg/mL，對革蘭陰性的致病性大腸桿菌K88的MIC為32μg/mL，但高濃度的LFM-3對雞血紅細(xì)胞有輕微的溶血性。
　　 根據(jù)雜合抗菌肽LFM-3的氨基酸序列，選用酵母偏愛密碼子，確定目的基因的堿基序列，

5、對其進(jìn)行必要設(shè)計(jì)后交由公司合成。XbaⅠ與XhoⅠ雙酶切亞克隆到穿梭載體pPICZαA中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，大量抽提純化重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SacⅠ單酶切線性化后，電擊轉(zhuǎn)化入表達(dá)宿主巴斯德畢赤酵母SMD1168中，待陽性轉(zhuǎn)化子生長到直徑約為2mm時(shí)，依次點(diǎn)種至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS選擇平板上，以在最高濃度Zeocin上仍能正常生長的轉(zhuǎn)化

6、子為高拷貝轉(zhuǎn)化菌株。對陽性重組酵母進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，初步檢測重組表達(dá)上清的抗菌活性，結(jié)果顯示，表達(dá)上清對金黃色葡萄球菌CowanⅠ與大腸桿菌K88的抑菌圈直徑分別達(dá)到20mm與17mm。而作為陰性對照的空載體表達(dá)上清對金黃色葡萄球菌CowanⅠ與大腸桿菌K88均沒有抑菌圈出現(xiàn)。對重組抗菌肽的震蕩培養(yǎng)表達(dá)條件進(jìn)行摸索，結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)溫度為28℃、誘導(dǎo)甲醇濃度為0.5％以及誘導(dǎo)起始pH6.0的條件下，誘導(dǎo)表達(dá)72h后，重組抗菌肽得到了最