雜合抗菌肽CL23和LH28的分子設(shè)計與表達(dá).pdf

1、抗生素不規(guī)范使用加劇了耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生，給人類健康帶來嚴(yán)重威脅，迫待尋求新的抗菌制劑。抗菌肽不僅能直接抗菌，而且參與生物體免疫調(diào)節(jié)，是極具潛力的感染治療藥物。 本實驗嘗試基于抗菌肽結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系，使用生物信息學(xué)工具優(yōu)化設(shè)計與篩選雜合抗菌肽。選擇牛乳鐵蛋白衍生肽LFB15-W4,10、天蠶素A(cecropinA)、幽門螺桿菌肽HP(2-20)作為母體肽，截取不同片段進(jìn)行雜合，以求獲得高抗菌活性低溶血性的雜合肽。使用生物信息學(xué)具計

2、算雜臺肽的物化參數(shù)，預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，優(yōu)化參數(shù)和結(jié)構(gòu)，選擇合成了兩條最具潛力的雜合肽：CA(1-8)-LFB15W(4，10)，簡稱CL23；LUB15(W4，10)-HP(4-16)，簡稱LH28，并測定合成肽活性，驗證設(shè)計的合理性。與母體肽相比，雜合肽抗菌譜更廣，抗細(xì)菌活性增強(qiáng)，并且在有效抑菌濃度下無明顯溶血性：對大腸桿菌抑菌活性均比母體肽LFB15-W4，10提高了4倍；實驗結(jié)果表明抗菌肽兩親性是影響其抑菌活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征；疏水性過

3、強(qiáng)，正電荷過高會增加抗菌肽的溶血性。 本實驗嘗試建立雜合肽的大腸桿菌重組高效表達(dá)與純化分離系統(tǒng)。比較研究了對雜合肽的高效表達(dá)和純化的影響因素：單體和多聚體表達(dá)、不同融合蛋白標(biāo)簽的毒性屏蔽和表達(dá)促進(jìn)作用、融合蛋白酶法和化學(xué)法裂解、不同宿主對表達(dá)產(chǎn)物的耐受力。 首先，在E.coliBL21(DE3)中融合表達(dá)單體CL23與LH28。根據(jù)E.coli密碼子偏愛性設(shè)計基因，在其5’端設(shè)計Xa因子的酶切位點編碼序列和限制性內(nèi)切酶E

4、coRⅠ、NotⅠ酶切位點，選擇pET28a(+)、pET32a(+)和pET41a(+)作為表達(dá)載體，正確構(gòu)建了六個重組表達(dá)載體。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，pET28a重組載體在SDS-PAGE凝膠上沒有目的蛋白條帶，pET41a重組載體以包涵體形式表達(dá)融合蛋白；pET32a重組載體以可溶形式表達(dá)融合蛋白，利于后續(xù)酶切；選擇pET32a重組表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)純化，鎳離子親和層析柱(Ni柱)純化融合蛋白純度約90％。但Xa因子切割的特異性不強(qiáng)，

5、效率不高，增加了純化的難度；體系放大后，酶用量增加，成本增加。 在單體表達(dá)研究基礎(chǔ)上，選擇LH28進(jìn)行多聚體表達(dá)，提高雜合肽在融合蛋白中的比例，提高得率。多聚體重組肽與載體蛋白及各單體間均設(shè)計甲酸和羥胺的切割位點，按照太腸桿菌密碼子偏愛性，設(shè)計LH28單體基因，并在兩端設(shè)計非對稱性限制性內(nèi)切酶BbsⅠ酶切位點，用于單體間串聯(lián)；利用基因兩端的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ酶切位點，構(gòu)建重組克隆載體pUC19-LH28；以pUC1

6、9-LH28為模板PCR獲得LH28單體基因，并利用BbsⅠ酶切獲得線性載體pUC19和帶有粘性末端的單體基因；正確構(gòu)建了2-6聚體和8聚體的重組克隆載體pUC19-(LH28)2-6,8。利用限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和HindⅢ酶切位點，將多聚體基因序列插入到pET32a(+)，正確構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET32a-(LH28)2-6,8。誘導(dǎo)表達(dá)引起宿主大腸桿菌BL21(DE3)OD600mm明顯下降，而宿主大腸桿菌C41(DE3)與C4

7、3(DE3)，誘導(dǎo)過程OD600mm沒有下降，其對外源蛋白表達(dá)的耐受力顯著高于BL21(DE3)。在SDS-PAGE凝膠上除了2聚體融合蛋白外，3-6和8聚體融合蛋白均沒有目的蛋白條帶；在相同誘導(dǎo)條件下C43(DE3)的菌體生長量(OD600mm)最高，C43(DE3)中融合蛋白Trx-(LH28)2表達(dá)量最高，占菌體總蛋白的35％，經(jīng)Ni柱純化，Trx-(LH28)2純度95％以上，1升發(fā)酵液可純化得到63mg；使用50％甲酸于50℃

8、，切割36h，Trx-(LH28)2被有效切割，Ni柱純化重組單體雜臺肽(P-LH-D)純度85％以上，對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌活性與合成肽LH28大體一致。 實驗結(jié)果表明利用生物信息學(xué)工具輔助設(shè)計和篩選雜合抗菌肽的方法，對雜合抗菌肽的分子設(shè)計具有一定的指導(dǎo)作用，節(jié)約了新型抗菌肽設(shè)計與篩選的時間和成本，雜合肽CL23和LH28可做為改造設(shè)計新型抗菌肽的模板。 本實驗實現(xiàn)了雜合肽LH28二聚體融合蛋白Trx-(LH28