牛MBD1基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)節(jié)及其對發(fā)育相關(guān)基因的作用.pdf

1、DNA甲基化是高等真核生物的一種重要的表觀遺傳修飾方式，通過改變?nèi)旧|(zhì)的空間構(gòu)象，富集特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子影響基因轉(zhuǎn)錄。其中甲基化CpG結(jié)合蛋白(methyl-CpG-binding domain protein，MBD)家族成員在DNA甲基化介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，MBD1能通過與低密度甲基化CpG結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)。
　　 本研究首先根據(jù)牛MBD1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR方法檢測牛五種成體組織中該基

2、因的表達(dá)情況，并針對該基因調(diào)節(jié)區(qū)的12個(gè)CpG位點(diǎn)，利用亞硫酸氫鹽測序PCR方法(bisulfite-sequencing PCR)分析不同成體組織中CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。其次，收集體外成熟不同培養(yǎng)階段卵母細(xì)胞(GV期、8h、12h、18h、24h)及體外受精不同發(fā)育時(shí)期胚胎(2-cell、4-cell、8-cell、囊胚)，檢測各階段MBD1基因的表達(dá)情況及該基因調(diào)控區(qū)CpG位點(diǎn)的DNA甲基化狀態(tài)。最后，利用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chr

3、omatin Immunoprecipitation assay，ChIP)技術(shù)檢測卵母細(xì)胞不同成熟階段(GV期、MⅡ期)及體外受精8-16細(xì)胞期胚胎中MBD1蛋白對多能性相關(guān)調(diào)控因子Nanog、Oct4和母源性相關(guān)分子Hlfoo及ZAR1等基因的調(diào)節(jié)作用。
　　 研究結(jié)果表明，牛五種不同組織中MBD1基因轉(zhuǎn)錄水平不同，其中在心臟、腎臟、肝臟、卵巢、睪丸的表達(dá)水平依次升高。不同組織中MBD1基因調(diào)節(jié)區(qū)12個(gè)CpG位點(diǎn)的DNA甲基

4、化狀態(tài)也呈現(xiàn)不同，心臟、腎臟、肝臟、卵巢、睪丸中DNA甲基化比率分別為49.17％、30％、87.50％、81.67％、79.17％。轉(zhuǎn)錄水平相對較低的心臟和腎臟中MBD1基因調(diào)節(jié)區(qū)的DNA甲基化比率低于轉(zhuǎn)錄水平相對較高的肝臟、卵巢和睪丸。
　　 不同成熟階段的卵母細(xì)胞和不同發(fā)育階段胚胎的研究結(jié)果表明，MBD1基因表達(dá)水平在不同成熟階段的卵母細(xì)胞均有表達(dá)且有顯著性差異，MBD1基因調(diào)節(jié)區(qū)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)及比率也沒有變化(

5、均為83.3％)，特別是ATG上游-443bp及-696bp位的CpG位點(diǎn)始終保持非甲基化狀態(tài)，其他CpG位點(diǎn)則始終保持甲基化狀態(tài)；在植入前胚胎發(fā)育階段，只在2-ce11期檢測到了MBD1基因的表達(dá)，從4-ce11期直到囊胚期均檢測不到MBD1基因的表達(dá)，MBD1基因調(diào)節(jié)區(qū)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)及比率與卵母細(xì)胞時(shí)期完全一致。
　　 ChIP結(jié)果顯示，在GⅤ期、MⅡ期卵母細(xì)胞及體外受精胚胎的8-16細(xì)胞期，MBD1蛋白始終與Hl

6、foo基因的調(diào)控區(qū)相結(jié)合；MBD1蛋白在GⅤ期和MⅡ期卵母細(xì)胞中與Nanog基因調(diào)控區(qū)相結(jié)合，在8-ce11期解離；MBD1蛋白在GV期卵母細(xì)胞中與Oct4基因調(diào)控區(qū)結(jié)合，在MⅡ期卵母細(xì)胞和8-ce11期處于解離狀態(tài)；MBD1蛋白在GⅤ期卵母細(xì)胞中與ZAR1基因調(diào)控區(qū)無結(jié)合，在MⅡ期卵母細(xì)胞中處于結(jié)合狀態(tài)，而在8-ce11期處于解離狀態(tài)。
　　 綜上所述，牛不同組織間的MBD1基因表達(dá)水平不同，其調(diào)節(jié)區(qū)的DNA甲基化水平和甲基化

7、模式也不同，表明DNA甲基化可能在調(diào)節(jié)MBD1基因的組織特異性表達(dá)中起作用。MBD1基因從卵母細(xì)胞不同成熟階段到2-cell胚胎期維持相對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄水平，2-cell胚胎期之后檢測不到MBD1基因的表達(dá)，但MBD1基因調(diào)節(jié)區(qū)的CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)未發(fā)生改變，與之前卵母細(xì)胞及2-cell胚胎期相同，說明MBD1在卵母細(xì)胞成熟過程中積累并作用于早期胚胎發(fā)育，也表明著MBD1基因的表達(dá)受DNA甲基化、其他的表觀遺傳方式和轉(zhuǎn)錄后修飾等共同調(diào)節(jié)