雜色鮑早期發(fā)育相關(guān)基因的時(shí)空表達(dá)研究.pdf

1、雜色鮑（Haliotis diversicolor）作為軟體動(dòng)物腹足類的重要物種，不僅是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)貝類，而且是研究海洋無脊椎動(dòng)物幼體發(fā)育良好模型，對貝類早期發(fā)育機(jī)理的闡述具有重要的理論和實(shí)踐意義。當(dāng)前借助于新一代高通量測序技術(shù)平臺(tái)，大量海洋貝類基因資源被挖掘出來。這些基因中的大部分卻是功能未知的，因此發(fā)展和應(yīng)用新的實(shí)驗(yàn)手段系統(tǒng)地分析基因的功能成為當(dāng)前迫切需要解決的問題。
　　 本實(shí)驗(yàn)室先前通過454測序和基因表達(dá)聚類方法獲

2、得了大量的雜色鮑幼體發(fā)育相關(guān)基因，這些基因的表達(dá)具有明確的發(fā)育階段性，即僅在某些發(fā)育時(shí)期高水平表達(dá)。本研究針對其中一批差異表達(dá)基因和一系列同源基因進(jìn)行了功能上的探索:
　　 1、建立雜色鮑幼體原位雜交方法(WMISH)。建立了用于全胚原位雜交的幼體采集、麻醉、固定和保存方法，確保了幼體形態(tài)在兩年多的保存時(shí)間里的完整性與舒展性;建立了cRNA探針制備技術(shù)，通過T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到的6個(gè)基因cRNA探針序列具有極高準(zhǔn)確度;建

3、立了雜交流程并進(jìn)行優(yōu)化，降低了背景信號(hào)，獲得了較高清晰度的原位雜交照片。經(jīng)過6個(gè)基因的WMISH實(shí)驗(yàn)，表明此方法已經(jīng)完整建立并具有較高通量。
　　 2、以基因群為單位開展發(fā)育特征基因的時(shí)空表達(dá)模式研究。本研究以基因家族的方式或以時(shí)序表達(dá)模式的相關(guān)性挑選了4個(gè)特征基因群:SARP-19基因家族、Vdg-3基因家族、與CMBL基因的時(shí)序表達(dá)模式相類似的基因群、與Fucolectin基因的時(shí)序表達(dá)模式相類似的基因群，并獲得了這些基因群

4、共15個(gè)基因的時(shí)空表達(dá)模式。SARP-19和Vdg-3基因家族大部分成員在附著后幼體的消化腺高水平表達(dá);CMBL基因群多在扭轉(zhuǎn)后面盤時(shí)期開始表達(dá)，空間上集中于套膜腔、外套膜邊緣、頂端感受器官，可能與幼體探索合適附著基、附著變態(tài)以及次生殼形成有密切聯(lián)系;Fucolectin基因群多在感受態(tài)期間高水平表達(dá)，空間上成局部“點(diǎn)狀”模式，這些表達(dá)位點(diǎn)鑒定為神經(jīng)節(jié)部位，因此很可能是與神經(jīng)系統(tǒng)在幼體早期的發(fā)育有密切關(guān)系。
　　 3、HdEGF

5、1基因的克隆、qPCR和WMISH。運(yùn)用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了HdEGF1基因全長cDNA序列。該基因全長1239bp，含一個(gè)343個(gè)氨基酸殘基的ORF（開放閱讀框），推測的蛋白序列包含3個(gè)EGF-CA結(jié)構(gòu)域和1個(gè)vWFA結(jié)構(gòu)域。通過序列相似性比較，我們確定其為新型EGF1相關(guān)蛋白。熒光定量PCR(qPCR)結(jié)果顯示HdEGF1基因在幼體附著后的表達(dá)量比附著前任一時(shí)期均高19倍以上。全胚原位雜交(WMISH)結(jié)果顯示

6、HdEGF1基因的集中表達(dá)在變態(tài)后幼體后消化道的表皮細(xì)胞。HdEGF1基因的這種時(shí)空表達(dá)模式表明HdEGF1受嚴(yán)格的時(shí)空調(diào)控，直接參與了附著后雜色鮑幼體后消化道的生長和細(xì)胞分化。
　　 4、CMBL蛋白的原核表達(dá)。根據(jù)已獲得的雜色鮑CMBL的cDNA序列，成功構(gòu)建了pET-CMBL的重組融合表達(dá)質(zhì)粒，重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，所獲得的CMBL融合蛋白主要以可溶形式存在于菌體中。利用親和純化的方法純化