家兔毛囊發(fā)育規(guī)律及其相關(guān)基因的遺傳效應(yīng)、表達規(guī)律研究.pdf

1、對于毛用動物而言，其被毛有著重要的經(jīng)濟價值。尋找影響動物毛質(zhì)性狀的候選基因一直是眾多研究的目標(biāo)，目前的研究主要集中于人和羊，而在家兔中的研究很少，這大大制約了毛兔育種的進展。
　　 毛發(fā)中的角蛋白相關(guān)蛋白(Keratin Associated Protein，KAP)是毛發(fā)的基本結(jié)構(gòu)成分之一，在毛皮質(zhì)中，角蛋白所構(gòu)成的中間微絲纖維(Intermediate Filaments，IFs)包埋在由KAP構(gòu)成的基質(zhì)中，二者以半胱氨酸(

2、Cys)殘基連接形成二硫鍵，共同形成毛干。在哺乳動物中，角蛋白和角蛋白相關(guān)蛋白占毛纖維總重的65～95％，是組成毛纖維的骨架。FGF5在小鼠和大鼠體內(nèi)有重要的生物學(xué)功能，尤其是皮膚毛囊的周期性生長的重要調(diào)控因子，是目前研究發(fā)現(xiàn)唯一與毛長有直接關(guān)系的基因。
　　 因此，對KAPs基因和FGF5基因的研究對于家兔的毛用性狀育種具有一定的意義。
　　 本研究中采取了PCR-SSCP和PCR-RFLP技術(shù)分析了閩西南黑兔、海貍色

3、獺兔、白色獺兔、九疑山兔、皖系長毛兔群體的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5基因的遺傳多樣性;量取福建黃兔、德系長毛兔、美系獺兔(2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)頸部、背部、臀部、腹部粗毛和細毛的長度，以分析家兔兔毛的生長情況;對福建黃兔、德系長毛兔、美系獺兔(0周齡、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)的背部和臀部皮膚組織進行了組織切片觀察，以分析其毛囊不同時期的

4、組織學(xué)形態(tài)變化;采用了實時熒光定量PCR技術(shù)對福建黃兔、德系長毛兔、美系獺兔(0周齡、2周齡、4周齡、6周齡、8周齡、12周齡、16周齡、20周齡)的背部和臀部皮膚組織中KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5的表達規(guī)律進行了分析。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1.本研究首次獲得了家兔KAP3.1、KAP3.3基因的全長CDS序列。并將家兔KAP3.1和KAP6.1基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(HM147283和

5、HM147284，HM068868和HM068869)。經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫中與其它物種序列的比對，家兔KAP3.1，KAP3.3，KAP6.1和FGF5基因序列與小鼠、豬、人、黑猩猩、牛等哺乳動物的同源性均達80％以上，一方面說明這些基因在不同物種中存在著一定的差異，另一方面說明了這些基因在進化過程中是相對比較保守的。
　　 本研究對不同家兔群體的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5基因的全長CDS區(qū)域進行了多

6、態(tài)性檢測。KAP3.1基因于KAP3.1-1座位上發(fā)現(xiàn)C91T突變，處于編碼區(qū)內(nèi)，但未引起氨基酸發(fā)生改變(均為絲氨酸)，為沉默突變。KAP3.3基因于KAP3.3-2座位中，發(fā)生了A358 G、CA373-374TG、A435 G和G467 T等四處突變位點，但這些突變位點均處于3’端非編碼區(qū)。本實驗所擴增KAP6.1基因的包括了5’端序列的基本元件(CAAT盒、增強子、CACCC盒、TATA盒)，相對于GenBank中的原序列(M95

7、718)，分別在5’端側(cè)翼區(qū)發(fā)現(xiàn)5處插入突變和CDS區(qū)域6個堿基的缺失。KAP6.1-1座位存在2種等位基因，C1等位基因相對C2等位基因在原序列的694位點上有1個插入(G)，并發(fā)生了G744 C和A755 G突變，且A755 G突變處于該序列的增強子區(qū)域。在FGF5基因上，F(xiàn)GF5-1A座位中，220～222處發(fā)現(xiàn)了TCT堿基的缺失，即絲氨酸缺失;在FGF5-3B擴增產(chǎn)物的中發(fā)現(xiàn)了T58 C突變，導(dǎo)致該位點編碼的亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，

8、這兩個突變位點，造成了家兔FGF5基因序列的變化。其他基因座位則未檢測出多態(tài)位點。
　　 所有群體在具有突變的位點上都處于Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。KAP3.1-1座位的多態(tài)信息含量都較低，各群體的整齊度較高，其原因可能長期的選育過程可能對該基因的影響不大。在KAP3.3-2座位中，閩西南黑兔、海貍色獺兔、九疑山兔的多態(tài)信息含量差異不大，均處于中度多態(tài)，說明三個群體受到的自然和人工選擇的選擇壓大小相當(dāng)。而

9、在KAP6.1-1座位中C1等位基因頻率較高，肉兔(閩西南黑兔、九疑山兔)的多態(tài)信息含量高于獺兔和毛兔，同時皖系長毛兔的多態(tài)信息含量為0，F(xiàn)GF5-1A座位中，E1等位基因頻率較高，并且皖系長毛兔群體中未發(fā)現(xiàn)E2等位基因，其原因可能本研究所采的樣本數(shù)不夠大，也可能是長毛兔、獺兔均是由肉兔突變而來，對于毛兔、獺兔的長期選育過程可能造成C2和E2等位基因頻率的降低所致。
　　 2.本研究中以不同家兔品種初生后至青年期不同皮膚部位為研

10、究對象，分析比較了毛囊發(fā)育情況，同時測量了不同家兔品種不同時期兔毛的長度以分析其生長情況。
　　 福建黃兔的初級毛囊直徑不同時期增長幅度最大，德系長毛兔次之，而美系獺兔增長的幅度最小，而平均次級毛囊直徑差異不大。家兔毛發(fā)生長前期(初生后)，各個品種均較難發(fā)現(xiàn)粗毛，而后期，福建黃兔、德系長毛兔粗毛率明顯上升，與家兔的毛發(fā)直徑情況相符。
　　 德系長毛兔、福建黃兔、美系獺兔的次級毛囊不同時期的直徑差異不大，但在形態(tài)上具有較大

11、的區(qū)別。說明家兔的毛囊發(fā)育與羊相似，也具有周期性，且該周期與家兔的年齡性換毛時間情況相符。
　　 德系長毛兔、福建黃兔、美系獺兔的平均表皮層厚度差異不大。美系獺兔的平均表皮層厚度和皮膚總厚度(表皮層厚度+真皮層厚度)最大，福建黃兔次之，德系長毛兔最小。肉兔和皮兔的皮膚厚度要高于毛兔。
　　 家兔毛長性狀的測定時，相同兔種中不同部位的毛長并不相同，所有兔種的背部、臀部被毛比頸部、腹部長;而同一部位的粗毛長度比細毛略長。不同

12、家兔兔毛的生長波持續(xù)時間和強度不同，皮兔和肉兔的兔毛生長波持續(xù)的時間較毛兔短，而早期強度高于毛兔。
　　 3.本研究采用了實時熒光定量PCR技術(shù)首次對福建黃兔、德系長毛兔、美系獺兔不同部位皮膚組織的KAP3.1、KAP3.3、KAP6.1和FGF5等基因的表達規(guī)律進行了分析，發(fā)現(xiàn)這些基因在相同兔種、同一時間點不同皮膚組織中的表達情況并不完全相同。
　　 KAP3.1基因在所有品種中0周齡時的表達量均處于較高的水平，且在福

13、建黃兔和美系獺兔中的表達量高于德系長毛兔。德系長毛兔不同性別、皮膚部位的表達規(guī)律相似，總體上均處于緩慢上升趨勢。而福建黃兔和美系獺兔KAP3.1基因的表達則出現(xiàn)較大的波動，多數(shù)部位在4周齡和12周齡時都有不同程度地下降趨勢，所不同的是該基因在福建黃兔12周齡母兔背部的表達量出現(xiàn)小幅度的上升，而在美系獺兔中出現(xiàn)顯著下降，至最低點。
　　 不同家兔品種的KAP3.3基因的表達趨勢與KAP3.1的表達趨勢基本相同。
　　 KA

14、P6.1基因在三個品種中不同部位不同時期的總體表達趨勢均處于波動狀態(tài)。福建黃兔中，不同性別背部和臀部都是在4周齡時表達量達到最低，除在12周齡母兔臀部的表達量達到最高外，其余都是在16周齡表達量達到最高。德系長毛兔中，0～6周時，背部和臀部間的表達差異較大。美系獺兔中，所有不同性別和部位的表達趨勢相似，初生的仔兔均具有一定的表達量，但是不同性別和部位間的差異較大。4周齡時均降至一個較低水平，隨后有所回升且逐漸趨于平緩。
　　 初

15、生仔兔不同部位均存在一定的FGF5基因表達量，且福建黃兔表達量最高，美系獺兔次之，德系長毛兔最低。福建黃兔中，雖然該基因在各階段不同性別不同部位的皮膚組織中的表達量有所不同，但整體趨勢基本一致。美系獺兔的表達規(guī)律與福建黃兔基本相同，但在12周齡時表達量的下降程度較福建黃兔明顯;而在德系長毛兔中，不同部位不同性別的表達趨勢較為相似，0周齡時，F(xiàn)GF5的表達量均處于最低點，隨后逐漸上升。
　　 本研究中所有群體的4個基因在家兔初生時

16、均具有一定的表達量，說明毛囊的發(fā)育和毛發(fā)的生長在家兔胚胎時期就已進行。4個基因在不同家兔品種中的表達趨勢并不完全一致，德系長毛兔的KAP3.1、KAP3.3、FGF5基因表達均呈現(xiàn)出一個緩慢上升的平滑趨勢，而KAP6.1基因則呈現(xiàn)出不規(guī)則的波動。4個基因在福建黃兔和美系獺兔4周齡和12周齡時均表現(xiàn)出較大程度地波動，推測可能與家兔的年齡性換毛有一定的關(guān)系。同時，肉兔和獺兔的各個基因的表達規(guī)律較為接近，此結(jié)果與家兔的不同經(jīng)濟用途較為接近。同