三角帆蚌微衛(wèi)星開發(fā)及在不同年齡與性別群體遺傳結構分析.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國主要的淡水育珠蚌,在我國五大淡水湖泊中資源豐富。但由于過度開發(fā)、環(huán)境污染等原因,三角帆蚌資源顯著減少,保護天然種質資源是開展三角帆蚌育種的基礎。本研究采用磁珠富集法開發(fā)了三角帆蚌20對多態(tài)性微衛(wèi)星,選用多態(tài)性高的10對微衛(wèi)星標記評價了鄱陽湖(PY)和太湖(TH)中不同年齡群體、不同性別群體的遺傳結構,分析了這些野生群體三角帆蚌的遺傳變化規(guī)律,并對新鮮組織與無水乙醇固定不同時間組織間D

2、NA提取效果及幼蚌活體取樣生長效果進行了比較,以期為三角帆蚌種質資源保護、資源評估及合理利用提供理論依據(jù),主要內(nèi)容如下。
　　1.三角帆蚌微衛(wèi)星位點篩選及多態(tài)性分析
　　采用磁珠富集法,以生物素標記的(CA)10寡核苷酸為探針,構建了三角帆蚌基因組微衛(wèi)星富集文庫。根據(jù)微衛(wèi)星位點的側翼序列設計引物,隨機挑選擴增出與預期大小相符的32對引物,引物熒光標記后對洞庭湖群體的24個三角帆蚌個體分別進行PCR擴增,共篩選出20對多態(tài)性較

3、好的引物。結果表明,20個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)為5-20,有效等位基因數(shù)2.3213-13.2603。觀察雜合度和期望雜合度分別為0.3182-1.0000和0.5825-0.9461;PIC值0.5472-0.9199;其中14個位點符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。本研究篩選的20個微衛(wèi)星標記可作為三角帆蚌遺傳多樣性、種群遺傳結構等研究的理想分子標記。
　　2.三角帆蚌不同年齡間遺傳多樣性分析
　　

4、采集了鄱陽湖3~8齡297個和太湖7~15齡217個野生三角帆蚌,用10對具有高度多態(tài)性微衛(wèi)星引物,分別對上述不同年齡群體遺傳多樣性進行分析,結果表明:不同年齡群體間平均期望雜合度和平均Nei’s基因多樣性變化不大,說明鄱陽湖和太湖不同年齡群體間遺傳多樣性差異不明顯。比較平均等位基因數(shù)、平均期望雜合度和平均多態(tài)信息含量,發(fā)現(xiàn)鄱陽湖7齡群體及8齡群體平均等位基因數(shù)和平均多態(tài)信息含量低于3齡至6齡群體,太湖9齡群體低于10齡群體、13齡群體

5、低于12齡群體和15齡群體,而其平均期望雜合度卻相對較大。不同年齡群體內(nèi)個體基因雜合度結果顯示鄱陽湖7齡群體及8齡群體、太湖9齡群體及13齡群體個體基因雜合度大的比例相對較高。根據(jù)重大環(huán)境變化情況劃分了不同年齡段,遺傳參數(shù)結果顯示,鄱陽湖3~5齡群體(PY1)遺傳多樣性低于鄱陽湖6~8齡群體(PY2);太湖7~9齡群體(TH1)遺傳多樣性最高,其次為13~15齡群體(TH3),10~12齡群體(TH2)遺傳多樣性最小。10個微衛(wèi)星位點等

6、位基因差異顯示,鄱陽湖不同年齡群體中除位點HcuCA0007、HcuCA0104外,其余8個位點在6齡(PY6Y)以后的群體中均出現(xiàn)等位基因丟失,太湖不同年齡群體中除位點HcuCA0100外,其余9個位點自9齡(TH9Y)開始均檢測到新的等位基因。
　　3.三角帆蚌不同性別間遺傳多樣性分析
　　采集了鄱陽湖雌蚌131個,雄蚌166個,太湖雌蚌118個,雄蚌99個,用10對具有高度多態(tài)性微衛(wèi)星引物,分別對上述鄱陽湖和太湖野生三

7、角帆蚌雌雄群體遺傳多樣性進行分析。結果表明:鄱陽湖雌雄群體的平均等位基因數(shù)分別為16.6和17.8,平均期望雜合度分別為0.811和0.813,平均Nei’s基因多樣性分別為0.8079和0.8106;太湖雌雄群體的平均等位基因數(shù)分別為14.2和17.6,雌雄群體的平均期望雜合度分別為0.7633和0.7747,平均Nei’s基因多樣性分別為0.7601和0.7708。鄱陽湖和太湖雄性群體的平均期望雜合度和平均Nei’s基因多樣性都略高

8、于雌性群體,結果表明雄性群體遺傳多態(tài)性略高于雌性群體。
　　4.三角帆蚌新鮮組織與無水乙醇固定不同時間組織間DNA提取效果比較
　　利用酚-氯仿法分別提取三角帆蚌下列組織中的DNA:鰓、斧足、外套膜、閉殼肌4種新鮮組織,無水乙醇固定7天的上述組織,常溫保存1年、3年、4年和5年固定的外套膜組織。對這些組織的DNA提取質量和PCR擴增效果進行比較分析。結果表明,斧足、外套膜和閉殼肌新鮮和固定7天的組織,提取的DNA濃度較高、降

9、解不明顯、PCR擴增效果較好,是提取三角帆蚌基因組DNA的好材料;但鰓新鮮和固定7天的組織,在提取DNA過程中易于降解,不適于作為三角帆蚌基因組DNA提取的樣本材料。經(jīng)無水乙醇固定7天組織均較新鮮組織提取的DNA,濃度高,降解少,SSR-PCR效果未見明顯差異,說明無水乙醇處理新鮮組織可提高DNA提取效果。與無水乙醇固定7天后提取的三角帆蚌基因組DNA相比較,保存1年以上的樣品所提取DNA均有不同程度的降解,不適于提取高質量DNA。保存

10、1年和3年外套膜組織提取的DNA降解水平對PCR擴增效果影響不顯著,保存4年、5年的外套膜組織DNA降解水平對PCR擴增效果影響顯著,需提高PCR模板用量。
　　5.三角帆蚌幼蚌活體取樣生長效果比較
　　比較分析幼蚌剝離微量外套膜組織用于DNA提取后的生長效果,結果顯示，DNA大分子條帶清晰明亮,DNA的濃度在42~130ng/μl,DNA含量在3360ng以上,OD260/OD280值在1.8以上,都能達到穩(wěn)定生長狀態(tài),且