家蠶W染色體特異轉基因品系的建立及ZFN打靶初探.pdf

1、昆蟲不育技術(SterileInsectTechnique,SIT)是一種無污染并且物種特異的害蟲控制方法,是害蟲大面積綜合治理(AreaWide-IntegratedPestControl,AW-IPM)的重要組成部分。這一技術的廣泛運用可以明顯減少人們對有機殺蟲劑在控制害蟲中的依賴,更好的保護生態(tài)環(huán)境。遺傳區(qū)性品系(geneticsexingstrains)是昆蟲不育技術中的重要課題,在害蟲防治中,單一釋放不育雄蟲要比雙性釋放效率高

2、,這主要是因為釋放不育害蟲之間更傾向于同型交配,影響控制靶標害蟲的效率;而且,許多害蟲的雌蟲起著主要的危害作用,雙性釋放會導致一些不必要的危害。更高效率地分離雌雄,有助于提高SIT項目的效率。
　　 家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲,也是鱗翅目的主要模式物種,在家蠶中發(fā)展遺傳區(qū)性品系有助于提升蠶絲產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益,對鱗翅目害蟲SIT項目也有參考價值。相對于雌蠶,雄蠶易養(yǎng)且不易患蠶病,食取的桑葉量少:雄蠶的吐絲量高,高出雌蠶約20%;雄蠶吐絲的品

3、質也明顯優(yōu)于雌蠶。專養(yǎng)雄蠶一直是蠶桑生產(chǎn)者追求的目標。前蘇聯(lián),日本和中國的研究者均進行過一些有益的探索,其中,前蘇聯(lián)科學家Strunnikov通過傳統(tǒng)的輻射生物學及染色體易位技術培育出的性連鎖平衡致死品系最有實用價值,目前國內推廣的雄蠶品種均是在該理論框架基礎上改造的。但Strunnikov的方法需要找到合適的標記基因以及長期大量的篩選工作,很難在不同的物種間推廣,成本很高。Marco等人提出了一種通過轉基因技術,實現(xiàn)鱗翅目遺傳區(qū)性品系

4、的策略,在針對蘋果小卷蛾SIT項目中,一個條件致死基因插入到W染色體上,給予一定條件,雌性死亡,釋放的雄性(性染色體為ZZ型)為不含轉基因的個體,在不影響不育雄性競爭力的同時避免了轉基因會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害的擔憂。但鱗翅目轉基因技術的基礎均為隨機插入,目前為止,仍然沒有W染色體轉基因插入的文獻報道。
　　 鋅指核酸酶(ZFNs)由識別特異DNA序列的鋅指結構域和非特異性的核酸內切酶Fokl兩部分組成。特異設計的ZFN可以介導靶D

5、NA序列的雙鏈斷裂(DSB),利用細胞自身的DNA修復機制(非同源末端連接NHEJ或同源重組修復HDR)引入基因突變,基岡修飾或基因添加,從而實現(xiàn)對生物體遺傳信息的定向改變。ZFNs已經(jīng)在多個物種和細胞中成功進行了基因敲除或定點基因添加,隨著鋅指核酸酶技術的發(fā)展,利用該技術在家蠶中實現(xiàn)定點轉基因似乎變得可行。但對于家蠶來說,ZFN是否能夠實現(xiàn)高效率基因打靶還需進一步的實驗證據(jù)。
　　 本研究調查了家蠶160個轉基因系,統(tǒng)計轉基因

6、陽性的性別比例,以期找到插入到W染色體上的轉基因系,再通過分子生物學方法,證明這一轉基因系;設計了GFP靶向的ZFN,以家蠶轉基因系pBac[Serl-Rcd-sv40,3xp3EGFP](該轉基因系繭殼發(fā)紅色熒光,復眼表達綠色熒光蛋白)為打靶對象,體外合成GFP-ZFN的mRNA,通過胚胎顯微注射該mRNA,探索GFP-ZFNmRNA對轉基因家蠶GFP基因的打靶效率。主要結果如下:
　　 1.W染色體轉基因家蠶的獲得
　

7、　 在本實驗中,我們調查了家蠶160個轉基因系,在對轉基因系的熒光分析中發(fā)現(xiàn),編號為158和159的轉基因系存在一定的性別熒光比例。我們對這兩組轉基因系與野生品系進行了雜交或自交處理,158轉基因系的后代沒有出現(xiàn)性別和熒光比例的差異,159轉基因系的后代中,雌性個性全部為EGFP陽性個體,雄性個體部分為EGFP陽性,我們推測該轉基因系含有兩個轉基因插入拷貝,一個在常染色體上,另一個在性染色體上,進一步對該轉基因系與野生品系進行雜交分離

8、,得到編號為30-13的轉基因品系,后代中雌性全為轉基因陽性,雄性全為轉基因陰性。根據(jù)孟德爾遺傳定律推測,30-13轉基岡品系的為W染色體轉基因品系。
　　 2.W染色體轉基因家蠶的分子檢測
　　 我們首先提取了30-13雌性與30-13雄性的基因組,根據(jù)EGFP序列設計了引物,以野生雌雄蠶的基因組作為對照組,通過PCR檢測,初步證明了30-13轉基因品系為w染色體插入。為了確定30-13轉基因品系的拷貝數(shù),我們對該品系

9、做了Southernblot檢測,運用了兩組內切酶(Xbal和Bgill)對30-13轉基因品系的雌雄蠶基因組進行酶切,實驗結果顯示,30-13轉基因品系為單拷貝插入,反向PCR結果顯示該轉基因的插入位點位于W染色體上。
　　 3.GFP-ZFN的mRNA打靶效率的初探
　　 本實驗選取家蠶轉基因系pBac[Serl-Red-sv40,3xp3EGFP]為基因打靶實驗品種,我們設計了GFP靶向的鋅指核酸酶,鋅指核酸酶核酸