豬鏈球菌與宿主細(xì)胞的相互作用以及毒力相關(guān)蛋白HP0197的功能研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一種重要的細(xì)菌性豬病病原，其常給全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。當(dāng)感染S.suis后，病豬通常會出現(xiàn)腦膜炎，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎，以及敗血癥等癥狀。該菌按照血清型的不同，可分為33個血清型(1型-31型，33型和1/2型)，其中豬鏈球菌血清型2型(Streptococcus suis serotype2，SS2)在世界范圍內(nèi)被廣泛報道為最主要的致病性血清型。另外，S.suis也是一種

2、重要的人畜共患病病原。從丹麥的第一例人感染豬鏈球菌病例開始，S.suis已經(jīng)在全球至少20個國家造成超過700人感染。盡管豬鏈球菌已在全球引起了高度的關(guān)注，然而當(dāng)前對其致病機理的研究還很有限。病原菌粘附到宿主細(xì)胞或組織表面以及其隨后的侵入與擴散過程是病原菌致病的關(guān)鍵步驟。并且病原菌與宿主之間的相互作用參與著所有這些過程。因此，研究病原菌的致病機理也就是研究病原菌與宿主的相互作用過程。本研究試圖以一些S.suis的表面毒力相關(guān)蛋白為誘餌，

3、通過鑒定該蛋白與宿主細(xì)胞之間的相互作用，為解釋其生物學(xué)功能與致病機理提供理論依據(jù)；另一方面，能夠與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用的細(xì)菌表面蛋白大多參與著細(xì)菌的致病過程。因此，本研究希望能夠通過大規(guī)模系統(tǒng)的方法將這部分蛋白鑒定出來，其將為進一步的研究病原菌的致病機理提供研究基礎(chǔ)；病原菌的毒力相關(guān)蛋白通常也是其重要的保護性抗原，因此本研究所鑒定的細(xì)菌表面蛋白極有可能被開發(fā)成為疫苗候選的分子，為解決豬鏈球菌病得防控提供幫助，而本研究也嘗試去評價這部分蛋

4、白的保護效力。現(xiàn)將主要研究結(jié)果報告如下：
　　 1.豬鏈球菌保護性抗原HP0197與宿主細(xì)胞之間的相互作用的研究
　　 在本研究前期的工作當(dāng)中，HP0197蛋白已被鑒定為SS2新型的保護性表面抗原和毒力相關(guān)蛋白。然而該蛋白的生物學(xué)功能尚不清楚，其在致病過程中的作用還有待于進一步證實。在本研究中，我們試圖通過鑒定HP0197與宿主細(xì)胞的相互作用過程，進而為闡明該蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。首先，我們通過間接免疫熒光實驗證

5、實了HP0197能夠與Hep-2細(xì)胞發(fā)生相互作用。進一步實驗顯示，這種相互作用可以被肝素和胰酶完全阻斷，其暗示著宿主細(xì)胞表面的類肝素的分子是HP0197的細(xì)胞受體。另外，HP0197還被發(fā)現(xiàn)能夠與葡萄糖相結(jié)合，因此HP0197可能參與著S.suis的能量代謝。為了證實這個推測，我們比較了△hp0197菌株和親本株在不同培養(yǎng)時期的HPr蛋白的生物學(xué)活性。結(jié)果顯示：當(dāng)hp0197基因缺失后，菌株體內(nèi)的HPr蛋白的磷酸化隨之改變，因此能夠進而

6、影響碳代謝調(diào)節(jié)基因CcpA的功能。
　　 2.鑒定豬鏈球菌2型表面蛋白與宿主細(xì)胞表面分子之間的相互作用
　　 病原菌與宿主蛋白質(zhì)之間的相互作用參與著病原菌所有的感染過程。研究病原菌與宿主之間的相互作用能夠我們?nèi)胬斫饧?xì)菌病的致病機理。盡管目前這個領(lǐng)域已有少量的研究，但仍有待于全面的系統(tǒng)鑒定病原菌與宿主之間的蛋白質(zhì)相互作用過程。在本研究中，我們建立了一種名為基于親和層析的表面蛋白質(zhì)組學(xué)(AffinityChromatogr

7、aphy-based Surface Proteomics；ACSP)的新研究方法，該方法將親和層析技術(shù)和shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)(LC-MS/MS)相結(jié)合，可以用來大尺度系統(tǒng)的研究病原與宿主之間的相互作用。為了完成ACSP實驗，我們以錨定了天然的Hep-2細(xì)胞表面分子的樹脂為誘餌，用來從S.suis表面蛋白中捕獲潛在的互作分子。隨后，我們利用LC-MS/MS技術(shù)從捕獲物中鑒定出40個潛在的表面互作蛋白，這些蛋白中有3個蛋白已在前期

8、的研究中被證實。我們選取了8個重要的表面互作蛋白，并證實了其與Hep-2細(xì)胞的粘附作用。另外，3個新鑒定的表面互作蛋白的重組蛋白以及多克隆抗體能夠顯著的抑制S.suis與Hep-2細(xì)胞的粘附過程，因此這3個蛋白極有可能在S。suis與Hep-2細(xì)胞的相互作用過程中發(fā)揮著重要的作用。通過使用這個例子，我們證實了ACSP技術(shù)是一個非常有價值的研究病原菌與宿主相互作用的實驗工具。
　　 3.豬鏈球菌免疫原性蛋白HP0272的保護力評價

9、
　　 S.suis是一個重要的豬細(xì)菌病病原，其同時也是一個人畜共患病病原。開發(fā)新的有效疫苗能夠幫助我們控制S.suis的感染。HP0272是一個細(xì)菌表面免疫原性表面蛋白，其保護效力有待進一步的評價。在本研究的小鼠模型當(dāng)中，純化的重組HP0272能夠誘導(dǎo)顯著的抗體水平，并保護小鼠以抵抗致死劑量的SS2人工感染。另外，實時熒光定量PCR也證實HP0272為體內(nèi)誘導(dǎo)抗原。該基因在一半的S.suis參考血清型菌株以及大多數(shù)SS2臨床分