脂蛋白(a)與A群鏈球菌的相互作用.pdf

1、蛋白酶水解活性是許多病原生物穿越組織屏障進(jìn)行擴(kuò)散的重要因素，一些病原微生物可以和纖溶酶原(Plasminogen，Plg)結(jié)合，使Plg更易被宿主的纖溶酶原激活劑plasminogen activators，Pas)激活為纖溶酶(Plasmin，Pm)而水解組織屏障，還有一些病原生物可以分泌某些Pas，進(jìn)而激活吸附在其表面的Plg。因此可以說，Plg是病原菌致病的重要因子。
　　 脂蛋白(a)[Lipoprotein(a)，Lp

2、(a)]中的載脂蛋白Apo(a)與Plg有高度同源性，因此，Lp(a)可以影響纖溶系統(tǒng)而成為心血管疾病的獨(dú)立危險因子。近年來許多報道指出，Lp(a)可以抑制Plg與其受體(如纖維蛋白原)的結(jié)合或抑制纖溶酶原的激活，因此，課題組首次提出了Lp(a)可以干擾病原菌利用纖溶酶原系統(tǒng)致病，指出Lp(a)可能有抗病原微生物感染的作用。
　　 A群鏈球菌(group A streptococcus，GAS)是人類的重要致病菌之一。人Plg是

3、GAS致病的重要參與因子，其中GAS表面a-烯醇化酶(surface enolase，SEN)與Plg有較強(qiáng)的結(jié)合，本研究從M6血清型GAS菌株中克隆了SEN基因，構(gòu)建了全長(SEN)和敲掉C末端賴氨酸殘基(SENA434-435)的表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21中表達(dá)了此兩種重組蛋白(rSEN，rSENA434-435)。由于在重組蛋白的N末端連有6個組氨酸的標(biāo)簽(His-Tag)，因此利用鉆離子螫合瓊脂糖凝膠分離純化了此兩種重組蛋白

4、。
　　 采用ELISA、親和色譜層析以及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)：rSEN能和Lp(a)結(jié)合，且6氨基己酸(EACA)可以抑制結(jié)合，而rSEN△434-435不能與Lp(a)結(jié)合，說明rSEN的C末端賴氨酸殘基和Lp(a)上的賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)(lysine binding site,LBS)是rSEN與Lp(a)結(jié)合的位點(diǎn)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果。本研究也克隆表達(dá)了Apo(a)中含有LBS的KIV10結(jié)構(gòu)域(rKIV10

5、)。并用ELISA證明了rKIV10可以與rSEN特異性結(jié)合，而不能與rSEN△434-43結(jié)合。另外，Lp(a)與rKIV10都能夠抑制rSEN與Plg的結(jié)合。因而，本研究首次從分子水平證明了Lp(a)可能干擾Plg系統(tǒng)而發(fā)揮抗感染作用。
　　 為了進(jìn)一步探討Lp(a]的抗感染假設(shè)，本研究進(jìn)行了M6血清型GAS菌株(以下簡稱為M6)與Lp(a)的相互作用，證明了Lp(a)可以和M6結(jié)合，并能夠抑制M6與Plg的結(jié)合和與Plg的

6、共孵育激活，在體外證實(shí)了Lp(a)可能的抗感染作用。
　　 本研究還通過EACA抑制M6與Lp(a)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)、蛋白酶K消化處理等實(shí)驗(yàn)初步證明了Lp(a)是通過其中的LBS與M6表面蛋白的賴氨酸結(jié)合的。但由于M6表面有多種蛋白，且Plg受體表達(dá)種類和數(shù)目也不能確定,因此未能清晰地確定M6表面的Lp(a)受體。下一步實(shí)驗(yàn)有望通過構(gòu)建表達(dá)去除C末端賴氨酸殘基的SEN的M6突變體，并進(jìn)行其與Lp(a)的結(jié)舍作用來進(jìn)一步確定M6上的Lp

7、(a)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 總之，本研究首次證明了rSEN能夠與Lp(a)結(jié)合,并明確了rSEN的C末端賴氮酸殘基和Lp(a)中的LBS是其結(jié)合的主要位點(diǎn)。Lp(a)/rKIV10能夠抑制rSEN與Plg的結(jié)合,首次從分子水平證明了Lp(a)可能干擾Plg系統(tǒng)而發(fā)揮抗感染作用。也對Lp(a)抗其它病原菌感染的機(jī)制探討或感染防治提供了可能的研究思路或技術(shù)手段。本研究也首次在國際上發(fā)現(xiàn)Lp(a)通過其賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)與M6血清型GAS結(jié)合