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文檔簡(jiǎn)介
1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥甚至死亡,人類(lèi)感染該菌亦可導(dǎo)致發(fā)病,是一種重要的人畜共患病病原體。豬鏈球菌分35個(gè)血清型,其中2型分布最廣,致病性亦最強(qiáng)。國(guó)內(nèi)1991年在廣東省首次分離到SS2,隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)爆發(fā)SS2感染,危害嚴(yán)重。目前鏈球菌2型的致病機(jī)理尚未完全清楚,本實(shí)驗(yàn)采用抑制性差減雜交的方法對(duì)2型毒力菌株所攜帶的差異基因序列進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)了3
2、0個(gè)可能的毒力基因,并檢測(cè)了這些基因在其他血清型鏈球菌中的分布。 1.抑制性差戰(zhàn)雜交 為了獲得SS2新毒力基因,將SS2毒力菌株HA9801與無(wú)毒力菌株T15進(jìn)行抑制性差減雜交。提取兩株細(xì)菌基因組DNA,RsaI酶切回收。酶切的HA9801基因組分別連接兩個(gè)不同的接頭.經(jīng)過(guò)兩輪雜交后,PCR擴(kuò)增HA9801特有基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨機(jī)挑取420個(gè)轉(zhuǎn)化克隆,PCR分析其中408個(gè)為陽(yáng)性克隆。
3、2.可能毒力基因的篩選、鑒定 408個(gè)為陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物變性固定于尼龍膜,分別與地高辛標(biāo)記的HA9801及T15酶切基因組DNA雜交。獲得了30個(gè)毒力菌株HA9801特異的基因片段。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析,表明這些片段編碼了28種蛋白,如溶血素III相關(guān)膜蛋白、IV分泌系統(tǒng)VirB4成分、zeta毒素、DNA重組酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子、信使調(diào)節(jié)子及氨基酸透性酶等。參照98HAH33菌株全基因組序列,將這些片段進(jìn)行基因組定位分析,以了解它們?cè)诨蚪M
4、上的分布。 3.可能毒力基因片段的分布分析 根據(jù)豬鏈球菌2型人源98HAH33菌株全基因序列,選擇14個(gè)具有代表性的差減片段設(shè)計(jì)引物,PCR檢測(cè)這些片段在其他鏈球菌上的分布。結(jié)果表明,在SS2菌株中,除了無(wú)毒株T15全部陰性,其它不同地區(qū)不同年份均有不同程度分布,11株人源分離株全部呈陽(yáng)性。其它鏈球菌中,馬鏈球菌獸疫亞種多為陰性,SS1、SS7和SS9各有其分布特點(diǎn)。 4.豬鏈球菌2型IV分泌系統(tǒng)VirB4蛋白及
5、DNA重組酶的表達(dá) 根據(jù)已發(fā)表的豬鏈球菌2型人源98HAH33株的IV分泌系統(tǒng)VirB4成分和DNA重組酶的基因序列,分析選擇免疫原性較高部分的基因序列設(shè)計(jì)和合成兩對(duì)引物,并以HA9801株的基因組DNA為模板,通過(guò)PCR技術(shù),擴(kuò)增出這兩個(gè)蛋白部分基因并定向克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)中。重組質(zhì)粒通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá),SDS-PAGE顯示兩表達(dá)產(chǎn)物約30kD,Western
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