豬鏈球菌2型可能毒力基因的鑒定及分析.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis)能引起豬腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥甚至死亡，人類(lèi)感染該菌亦可導(dǎo)致發(fā)病，是一種重要的人畜共患病病原體。豬鏈球菌分35個(gè)血清型，其中2型分布最廣，致病性亦最強(qiáng)。國(guó)內(nèi)1991年在廣東省首次分離到SS2，隨后于1998年和2005年分別在江蘇和四川部分地區(qū)爆發(fā)SS2感染，危害嚴(yán)重。目前鏈球菌2型的致病機(jī)理尚未完全清楚，本實(shí)驗(yàn)采用抑制性差減雜交的方法對(duì)2型毒力菌株所攜帶的差異基因序列進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了3

2、0個(gè)可能的毒力基因，并檢測(cè)了這些基因在其他血清型鏈球菌中的分布。 1.抑制性差戰(zhàn)雜交 為了獲得SS2新毒力基因，將SS2毒力菌株HA9801與無(wú)毒力菌株T15進(jìn)行抑制性差減雜交。提取兩株細(xì)菌基因組DNA，RsaI酶切回收。酶切的HA9801基因組分別連接兩個(gè)不同的接頭.經(jīng)過(guò)兩輪雜交后，PCR擴(kuò)增HA9801特有基因序列。擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。隨機(jī)挑取420個(gè)轉(zhuǎn)化克隆，PCR分析其中408個(gè)為陽(yáng)性克隆。

3、2.可能毒力基因的篩選、鑒定 408個(gè)為陽(yáng)性克隆的PCR產(chǎn)物變性固定于尼龍膜，分別與地高辛標(biāo)記的HA9801及T15酶切基因組DNA雜交。獲得了30個(gè)毒力菌株HA9801特異的基因片段。經(jīng)過(guò)比對(duì)分析，表明這些片段編碼了28種蛋白，如溶血素III相關(guān)膜蛋白、IV分泌系統(tǒng)VirB4成分、zeta毒素、DNA重組酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子、信使調(diào)節(jié)子及氨基酸透性酶等。參照98HAH33菌株全基因組序列，將這些片段進(jìn)行基因組定位分析，以了解它們?cè)诨蚪M

4、上的分布。 3.可能毒力基因片段的分布分析 根據(jù)豬鏈球菌2型人源98HAH33菌株全基因序列，選擇14個(gè)具有代表性的差減片段設(shè)計(jì)引物，PCR檢測(cè)這些片段在其他鏈球菌上的分布。結(jié)果表明，在SS2菌株中，除了無(wú)毒株T15全部陰性，其它不同地區(qū)不同年份均有不同程度分布，11株人源分離株全部呈陽(yáng)性。其它鏈球菌中，馬鏈球菌獸疫亞種多為陰性，SS1、SS7和SS9各有其分布特點(diǎn)。 4.豬鏈球菌2型IV分泌系統(tǒng)VirB4蛋白及

5、DNA重組酶的表達(dá) 根據(jù)已發(fā)表的豬鏈球菌2型人源98HAH33株的IV分泌系統(tǒng)VirB4成分和DNA重組酶的基因序列，分析選擇免疫原性較高部分的基因序列設(shè)計(jì)和合成兩對(duì)引物，并以HA9801株的基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)，擴(kuò)增出這兩個(gè)蛋白部分基因并定向克隆至表達(dá)載體pET-28a(+)中。重組質(zhì)粒通過(guò)PCR鑒定和測(cè)序后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行原核表達(dá)，SDS-PAGE顯示兩表達(dá)產(chǎn)物約30kD，Western