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文檔簡(jiǎn)介
1、目的
HSP100/ClpATPase是一類(lèi)高度保守而且廣泛存在的熱休克蛋白(heat shockprotein, HSP),屬于A(yíng)AA+(ATPase associated with diverse cellular activities)蛋白超家族,具有多種生物學(xué)功能。他們可以與蛋白酶ClpP結(jié)合形成ATP依賴(lài)的蛋白酶復(fù)合體促進(jìn)特異的底物蛋白質(zhì)的水解,而ClpATPase決定了ClpP的裂解功能和降解底物的特異性[3]
2、。大量研究已證實(shí)ClpATPase在許多病原菌的致病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在金黃色葡萄球菌,ClpX缺陷株的毒力顯著降低,這種作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)主要毒力因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[8]。在單核細(xì)胞增多性李斯特菌,ClpC通過(guò)調(diào)節(jié)侵襲相關(guān)毒力因子的表達(dá)參與細(xì)菌粘附侵襲宿主細(xì)胞的過(guò)程[10]。
我們課題組前期對(duì)肺炎鏈球菌ClpE的研究發(fā)現(xiàn):在小鼠腹腔感染模型clpE缺陷肺炎鏈球菌的致病能力明顯降低。那么ClpE影響細(xì)菌致病的機(jī)制如何呢
3、?即它是通過(guò)對(duì)哪些毒力因子的影響作用而調(diào)控細(xì)菌相應(yīng)的毒力表現(xiàn)呢?要想弄清這些問(wèn)題,就必須尋找到與ClpE有相互作用的特異性蛋白底物。本研究擬通過(guò)目前應(yīng)用廣泛的研究蛋白質(zhì)相互作用的大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)兩種方法來(lái)篩選ClpE的相互作用蛋白,進(jìn)一步進(jìn)行相應(yīng)的功能研究,初步揭示ClpE在肺炎鏈球菌中的作用機(jī)制。
方法
1.大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)篩選首先,是ClpE蛋白的表達(dá)純化和多克隆抗體的制備。我們構(gòu)建了
4、含His標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pET28a-ClpE,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)過(guò)夜表達(dá)后,采用鎳柱親和層析純化目的蛋白rClpE。進(jìn)一步應(yīng)用SDS-PAGE對(duì)表達(dá)和純化產(chǎn)物進(jìn)行分析后,透析除鹽。純化的rClpE抗原分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔,制備rClpE多克隆抗體。
其次,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE,經(jīng)PCR和測(cè)序證明載體構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號(hào)200192)。IPTG誘
5、導(dǎo)后采用Western blot驗(yàn)證ClpE的表達(dá)。同時(shí)共轉(zhuǎn)化pBT-ClpE和pTRG至大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號(hào)200192),觀(guān)察在NSSM、SSM平板上的生長(zhǎng)情況,對(duì)其自激活作用進(jìn)行檢測(cè),確定pBT-ClpE可以用于后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)。
再次,構(gòu)建文庫(kù)質(zhì)粒pTRG-DNA片段。我們采用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3AⅠ隨機(jī)酶切肺炎鏈球菌基因組DNA后,與經(jīng)過(guò)BamHⅠ酶切的質(zhì)粒pTRG連接過(guò)夜,轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號(hào)
6、240065)。從而最終得到含有不同大小DNA片段的文庫(kù)混合質(zhì)粒。
最后,誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE和文庫(kù)混合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)菌株(編號(hào)200190),在選擇性平板SSM上篩選陽(yáng)性克隆。
2.免疫共沉淀篩選構(gòu)建含GFP標(biāo)簽的載體pAE03-ClpE,轉(zhuǎn)入肺炎鏈球菌D39,形成菌株D39(ClpE::GFP)。將GFP單克隆抗體,Protein G磁珠以及D39(ClpE:: GFP)裂解液或D39裂
7、解液(對(duì)照)在4℃孵育過(guò)夜后,與ClpE有相互作用蛋白可能已結(jié)合于protein G。磁珠經(jīng)過(guò)PBS洗5次后,SDS-PAGE檢測(cè),兩組之間的差異條帶即為ClpE的相互作用蛋白。切膠后送深圳華大基因進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
3.ClpE對(duì)FtsW蛋白含量的影響研究在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)ClpE缺陷菌的細(xì)菌形態(tài)與野生菌相比存在差異,成長(zhǎng)桿狀,無(wú)中間的凹陷。進(jìn)一步電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)ClpE缺陷菌菌體要長(zhǎng)于野生菌。推測(cè)ClpE可能參與調(diào)控細(xì)胞分裂。生
8、物信息學(xué)分析顯示,我們所篩選的ClpE相互作用蛋白FtsW與細(xì)胞分裂相關(guān),因此我們對(duì)該蛋白進(jìn)行了初步的功能研究:通過(guò)Westernblot觀(guān)察熱應(yīng)激對(duì)FtsW表達(dá)的影響,通過(guò)β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)觀(guān)察ClpE在FtsW降解中的作用。
結(jié)果
1.成功構(gòu)建了ClpE原核表達(dá)載體pET28a-ClpE,獲得了純度大于85%的重組蛋白ClpE。純化的rClpE抗原分別免疫BALB/c小鼠和新西蘭大白兔,獲得了兔和鼠兩
9、種來(lái)源的rClpE多克隆抗體。
2.Western blot證實(shí)誘餌質(zhì)粒pBT-ClpE可以正常表達(dá),而且自激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)其無(wú)自主激活報(bào)告基因作用。通過(guò)大腸桿菌雙雜交系統(tǒng)的篩選,我們最終得到了25個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)過(guò)PCR和測(cè)序鑒定,有2個(gè)DNA片段在pTRG載體上有正確表達(dá),分別是細(xì)胞分裂蛋白FtsW和推測(cè)的組氨酸激酶SPD_2019。我們重新構(gòu)建了含有全長(zhǎng)片段的pTRG-FtsW/SPD_2019載體,并通過(guò)雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證他
10、們與ClpE具有相互作用。
3.通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的篩選,最終我們得到了6個(gè)ClpE相互作用蛋白,分別是丙酮酸氧化酶SpxB,氨肽酶PepN,1-乳酸脫氫酶Ldh,核糖體蛋白R(shí)psD,磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶PtsI,氨甲?;?磷酸合成酶CarB。我們選擇其中與細(xì)菌毒力密切相關(guān)的SpxB和PepN進(jìn)行了雙雜交系統(tǒng)的驗(yàn)證,證明這兩個(gè)蛋白與ClpE具有相互作用。
4.對(duì)FtsW蛋白的初步功能研究結(jié)果顯示,F(xiàn)t
11、sW在細(xì)菌處于熱應(yīng)激時(shí)表達(dá)增高。β-半乳糖苷酶活性測(cè)定顯示FtsW的降解在D39ΔclpE菌中要慢于野生菌。
結(jié)論
通過(guò)本研究共篩選到8個(gè)蛋白可能與ClpE具有相互作用,其中蛋白FtsW、SPD_2019、PepN和SpxB通過(guò)鑒定的確與ClpE具有相互作用,提示ClpE可能通過(guò)影響這些蛋白的含量影響細(xì)菌相關(guān)性質(zhì)及毒力;
細(xì)胞分裂蛋白FtsW的表達(dá)受熱應(yīng)激誘導(dǎo),而ClpE參與FtsW的降解,提示
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