絨山羊細(xì)胞中Rheb-FKBP38相互作用關(guān)系的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、mTOR信號通路調(diào)控細(xì)胞的生長、增殖和分化，Rheb和FKBP38是該通路中兩個重要的調(diào)節(jié)蛋白。Rheb是Ras超家族的一員，它是mTOR信號通路中的上游調(diào)節(jié)因子，具有整合營養(yǎng)和促細(xì)胞分裂信號的功能；FKBP38是免疫親和素FKBP家族中的一員，可與mTOR結(jié)合抑制其活性，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長。2007年首次報道：Rheb通過FKBP38調(diào)節(jié)mTOR活性，即Rheb通過與FKBP38結(jié)合釋放mTOR而使其具有活性；之后又有研究者采用不同的方

2、法證明Rheb與FKBP38沒有相互作用，各實驗室的研究報道出現(xiàn)不同的結(jié)論。值得指出的是，以上研究報道都是采用人細(xì)胞為材料的，關(guān)于絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中Rheb和FKBP38的研究尚未見報道。為了探討Rheb和FKBP38之間的相互關(guān)系，我們在已有報道的基礎(chǔ)上，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中Rheb和FKBP38之間的相互作用關(guān)系，以期通過新技術(shù)和新材料的應(yīng)用為二者之間關(guān)系的研究提供新的佐證，同時為絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中m

3、TOR信號通路的研究提供數(shù)據(jù)。
　　 本研究首先利用RT-PCR克隆絨山羊Rheb和FKBP38基因cDNA的CDS區(qū)，分析其表達(dá)模式；構(gòu)建真核表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞(GFb)，通過免疫共沉淀和Western-Blot鑒定蛋白Rheb和FKBP38的共同存在；最后利用酵母雙雜交技術(shù)并結(jié)合免疫共沉淀結(jié)果確定Rheb與FKBP38的相互作用關(guān)系。
　　 結(jié)果表明，內(nèi)蒙古白絨山羊Rheb基因ORF全長555bp，編

4、碼184個氨基酸(HM569224)，該基因在腦組織中表達(dá)量較高，在心臟組織中表達(dá)量較低；得到的FKBP38基因cDNA全長1248bp，包含了1236bp的ORF，編碼411個氨基酸(JF714970)，該基因在睪丸組織中表達(dá)量較高，在腎臟組織中表達(dá)量較低。
　　 利用得到的基因構(gòu)建真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-Rheb和pIRES2-DsRed2-FKBP38，共轉(zhuǎn)染GFb細(xì)胞，G418篩選兩周后提取蛋白進(jìn)行免疫共沉淀

5、和Western-Blot鑒定，結(jié)果在免疫共沉淀復(fù)合物中鑒定出Rheb與FKBP38。利用所得基因成功構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體pGBKT7-Rheb、pGBKT7-FKBP38和靶載體pGADT7-Rheb、pGADT7-FKBP38，結(jié)果顯示Rheb與FKBP38具有相互作用關(guān)系。綜合免疫共沉淀和酵母雙雜交結(jié)果，可以認(rèn)為二者可以發(fā)生直接相互作用。
　　 本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究證明了在絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞中Rheb與FKBP3