豬圓環(huán)病毒2型與豬小腸上皮細(xì)胞微絲骨架的相互作用.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine Circovirus type2，PCV2)可引起豬肉芽腫性腸炎，該病可經(jīng)消化道傳播，多致使仔豬腹瀉，近年來(lái)給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)一定經(jīng)濟(jì)損失。微絲骨架是細(xì)胞骨架的重要組成之一，其處于高度變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程中。它們一般以成束或成網(wǎng)的形式存在于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)，參與調(diào)控細(xì)胞的分裂、黏附、遷移和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程。由于病毒的生命進(jìn)程嚴(yán)格依賴宿主細(xì)胞，所以病毒為了創(chuàng)造有利于其入侵、復(fù)制、釋放和傳播的條件，逐漸進(jìn)化為能與宿主細(xì)胞微絲骨架

2、相互作用的類(lèi)型。既往研究表明，病毒可以利用囊泡運(yùn)輸和/或參與調(diào)控微絲骨架的信號(hào)通路完成自身的生命進(jìn)程。本試驗(yàn)以豬小腸上皮細(xì)胞系（intestinal porcine epithelial cell line，IPEC-J2）為試驗(yàn)對(duì)象，嘗試建立了PCV2感染腸道的體外細(xì)胞模型，并初步探索了其與宿主細(xì)胞微絲骨架之間的相互作用，為今后對(duì)PCV2通過(guò)消化道感染機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　1.豬圓環(huán)病毒2型對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞感染模型的初步

3、建立
　　本試驗(yàn)以TCID50為104.5/mL的PCV2為試驗(yàn)材料，感染豬小腸上皮細(xì)胞(IPEC-J2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCV2雖不能引起IPEC-J2細(xì)胞產(chǎn)生明顯病變;但能引起細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。經(jīng)透射電子顯微鏡觀察，感染后1h病毒顆粒分散在細(xì)胞微絨毛周?chē)?感染后48 h大量病毒顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，線粒體腫脹、基質(zhì)變淺、嵴變少變短并有形成空泡的趨勢(shì)。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IPEC-J2細(xì)胞對(duì)PCV2的易感性，發(fā)現(xiàn)從1h到72 h感染細(xì)

4、胞數(shù)呈上升趨勢(shì)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PCV2在IPEC-J2細(xì)胞上的增殖情況，在感染6h至96 h期間PCV2穩(wěn)定增殖，隨后病毒量開(kāi)始下降。為進(jìn)一步檢測(cè)PCV2對(duì)IPEC-J2細(xì)胞的持續(xù)感染力，將感染后的IPEC-J2細(xì)胞持續(xù)傳代，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV2可伴隨細(xì)胞傳代至第6代，感染能力呈急劇增長(zhǎng)的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，PCV2可以感染IPEC-J2細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)增殖，因此IPEC-J2細(xì)胞可以初步作為PCV2感染腸道研究的細(xì)胞模型。

5、>　　2.豬圓環(huán)病毒2型與豬小腸上皮細(xì)胞微絲骨架互作的研究
　　本試驗(yàn)研究了PCV2在感染豬小腸上皮細(xì)胞過(guò)程中，與宿主細(xì)胞微絲骨架之間的相互作用，并對(duì)此過(guò)程涉及的信號(hào)通路進(jìn)行了初步探索。應(yīng)用PCV2感染IPEC-J2細(xì)胞，以正常未感染的細(xì)胞為對(duì)照組。分時(shí)段檢測(cè)微絲的變化，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞的微絲骨架以平行成束的形式排列在細(xì)胞內(nèi);而感染PCV2的細(xì)胞微絲骨架發(fā)生了明顯的變化:感染后1h，微絲有聚合現(xiàn)象，較多短的絲狀肌動(dòng)蛋

6、白積聚形成小團(tuán)塊;感染后24 h、48 h和72 h，應(yīng)力纖維減少，絲狀肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)呈空洞狀，同時(shí)細(xì)胞界限更加明顯。流式細(xì)胞術(shù)定量發(fā)現(xiàn)感染組的微絲總量比對(duì)照組在1、24、48和72 h均有極顯著的增加（P＜0.01）。以微絲解聚劑（細(xì)胞松弛素D，CytD）或微絲穩(wěn)定劑（葫蘆素E，CuE）改變細(xì)胞微絲的結(jié)構(gòu)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和/或培養(yǎng)上清液中的病毒拷貝數(shù)。結(jié)果提示，微絲的聚合能促進(jìn)PCV2入侵IPEC-J2細(xì)胞;皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白的重構(gòu)有利于PCV2

7、從IPEC-J2細(xì)胞中釋放。為了進(jìn)一步探索PCV2與微絲骨架的相互作用，我們對(duì)此過(guò)程涉及的信號(hào)通路進(jìn)行了初步探索。在提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)微絲相關(guān)蛋白在mRNA表達(dá)水平上的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):感染后1h，對(duì)照組與感染組所選基因的表達(dá)無(wú)明顯差異;感染后48 h，感染組中與微絲成核有關(guān)的凝溶膠蛋白(gelsolin)發(fā)生了極顯著下調(diào)（P＜0.01），與應(yīng)力纖維形成有關(guān)的微絲骨架上游調(diào)控蛋白R(shí)hoA（P＜0.01）、RO