豬流行性腹瀉病毒對細(xì)胞微絲骨架及緊密連接的影響.pdf

1、微絲是支撐細(xì)胞的蛋白纖維網(wǎng)架系統(tǒng)，在細(xì)胞遷移、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)燃?xì)胞活動中起必不可少的作用。病毒作為嚴(yán)格的胞內(nèi)寄生者，為了創(chuàng)造有利于自身入侵、復(fù)制和釋放的環(huán)境，進(jìn)化了多種與宿主細(xì)胞骨架相互作用的機(jī)制，從而達(dá)到順利入侵、準(zhǔn)確到達(dá)復(fù)制位點(diǎn)進(jìn)行高效復(fù)制、以及快速、遠(yuǎn)距離傳播的目的。而細(xì)胞微絲被干擾后，細(xì)胞內(nèi)病毒的活動也會受到明顯抑制。廣義上的微絲骨架也包括緊密連接蛋白部分。豬流行性腹瀉是一種急性、接觸性、高度傳染性消化道疾病，近年來給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨

2、大經(jīng)濟(jì)損失。本文以豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2為試驗(yàn)對象，首次研究豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)與宿主細(xì)胞微絲骨架之間的相互作用，以及其對緊密連接的影響。填補(bǔ)豬流行性腹瀉感染機(jī)理方面的研究空白，為日后進(jìn)行豬流行性腹瀉病毒的深入研究提供一定基礎(chǔ)。
　　1.豬流行性腹瀉病毒感染IPEC-J2細(xì)胞的病理變化
　　本試驗(yàn)以vero細(xì)胞擴(kuò)繁、TCID50為105.5/mL的PE

3、DV試驗(yàn)材料，摸索合適的感染復(fù)數(shù)感染IPEC-J2細(xì)胞。以蔗糖密度梯度離心方法濃縮純化病毒，電鏡負(fù)染觀察病毒形態(tài)。見大量散在的、形態(tài)完整的病毒粒子，病毒粒子形態(tài)呈圓形、橢圓形、腎形和多邊形。以HE染色觀察感染PEDV的IPEC-J2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞腫脹變圓、折光性加強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)很多小空泡;伴隨空泡增多、逐漸合并形成大空泡，腫脹的細(xì)胞脫落、形成空隙;最終大量脫落的細(xì)胞碎片漂浮于細(xì)胞瓶中。RT-PCR方法檢測PEDV的增殖情況，在感染6h后

4、PEDV開始大量迅速增殖，12h達(dá)到最高峰，隨后病毒量逐步下降。電鏡觀察IPEC-J2細(xì)胞感染PEDV的超微結(jié)構(gòu)變化，通過掃描電鏡觀察可見細(xì)胞微絨毛大量脫落消失、微絨毛頂端膨大變圓、可見數(shù)根融合形成蘑菇樣膨大。透射電鏡結(jié)果顯示微絨毛內(nèi)部微絲束消失、細(xì)胞內(nèi)部微絲束紊亂、線粒體空泡化嚴(yán)重，細(xì)胞核膜與病毒接觸部分出現(xiàn)溶解，未接觸部分核膜界限清晰。結(jié)果說明，病毒可以在IPEC-J2細(xì)胞上復(fù)制增殖，出現(xiàn)典型的空泡狀病變，同時引起微絨毛脫落與細(xì)胞內(nèi)

5、部微絲骨架的紊亂。提示PEDV能夠引起細(xì)胞內(nèi)部微絲骨架的改變。
　　2.豬流行性腹瀉病毒對緊密連接的影響
　　本試驗(yàn)主要從細(xì)胞跨膜電阻的測定、腸上皮細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)來研究PEDV對腸上皮細(xì)胞屏障的影響，間接反映緊密連接完整性;隨后通過檢測細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)量來直接反映緊密連接的改變情況。PEDV感染IPEC-J2細(xì)胞的跨膜電阻值在感染后有短暫的上升，60min下降，直到12h電阻值再度高于正常對照組值。腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通

6、道轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)顯示，隨著感染時間的延長，熒光滲透性標(biāo)記分子在細(xì)胞旁路轉(zhuǎn)運(yùn)量不斷加大，轉(zhuǎn)運(yùn)率也逐漸增高。以Westernblot檢測PEDV對IPEC-J2細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)量的影響，發(fā)現(xiàn)緊密連接蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）和粘附連接蛋白（E-cadherin）的表達(dá)發(fā)生了不同程度的變化。Claudin-1和ZO-1這兩種蛋白的表達(dá)量下調(diào)顯著。到了60min，除了E-cadherin的表達(dá)量基本正常外，其余三種蛋白

7、的表達(dá)量均下降到了正常表達(dá)量的85％左右。結(jié)果提示，PEDV的感染對緊密連接蛋白的表達(dá)量影響較小，而結(jié)合PEDV對微絲的影響極為顯著，我們推測，PEDV可能并不依賴緊密連接蛋白作為入侵受體，而是病毒引起微絲骨架的重組，誘發(fā)近微絲環(huán)的收縮，從而導(dǎo)致緊密連接蛋白的變動。
　　3.豬流行性腹瀉病毒與微絲骨架的相互作用
　　本試驗(yàn)主要探討豬流行性腹瀉病毒在感染過程中與微絲骨架之間的關(guān)系。以FTTC-phalloidin染色法對感染后

8、的IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行觀察后發(fā)現(xiàn)，微絲骨架感染后發(fā)生有規(guī)律的變化，我們?nèi)藶榈貙⑽⒔z的變化劃分為五個不同時期:解聚一期(0-40min)，環(huán)膜期(60min)，解聚二期（80min-100min），環(huán)核期(6h-48h)，凋亡期(72h)。解聚一期，微絲開始解聚，微絲在細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)綠色霧狀;環(huán)膜期，部分微絲束開始恢復(fù)，在細(xì)胞膜下形成圍繞細(xì)胞的環(huán)狀高亮微絲束;解聚二期，微絲再次開始發(fā)生解聚，肌動蛋白彌散分布;環(huán)核期，微絲在細(xì)胞核附近堆積形成

9、散亂的斑塊，部分細(xì)胞在細(xì)胞膜下有一圈微絲形成的亮環(huán)，細(xì)胞間界限模糊;凋亡期，細(xì)胞大部分凋亡，脫落，殘存的細(xì)胞微絲聚集濃染，為典型的凋亡細(xì)胞染色特征。
　　以微絲穩(wěn)定劑(Jas)和細(xì)胞松弛素D(CytoD)改變細(xì)胞微絲的狀態(tài)，通過檢測細(xì)胞內(nèi)病毒的TCID50來反映病毒的侵染情況。Jas和CytoD都能夠干擾PEDV入侵、復(fù)制和釋放，CytoD影響PEDV復(fù)制和釋放的效果更為顯著(P＜0.01)。
　　結(jié)果提示，在PEDV感染宿