山羊生長(zhǎng)激素基因乳腺特異性基因打靶載體的構(gòu)建及陽(yáng)性細(xì)胞株的篩選.pdf

1、研究表明生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)可作用于乳腺間質(zhì)細(xì)胞的GH受體，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor1，IGF-1)，刺激乳腺腺泡的發(fā)育和增加乳腺血流量，達(dá)到維持泌乳和提高奶產(chǎn)量的作用。 本研究首先利用基因打靶技術(shù)將山羊GH基因定點(diǎn)導(dǎo)入山羊β-酪蛋白基因座中，構(gòu)建乳腺特異性基因打靶載體pLG，然后在細(xì)胞和乳腺組織中進(jìn)行功能驗(yàn)證。最后將pLG轉(zhuǎn)染山羊耳皮成纖維細(xì)胞進(jìn)行

2、篩選，為今后培育轉(zhuǎn)GH山羊奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究中主要試驗(yàn)內(nèi)容分為以下三部分:
　　 1.山羊β-酪蛋白基因5’和3’調(diào)控元件克隆及功能驗(yàn)證
　　 本試驗(yàn)的目的是擴(kuò)增山羊β-酪蛋白的3’和5’調(diào)控元件，構(gòu)建乳腺特異性打靶載體pGFP，通過(guò)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)驗(yàn)證β-酪蛋白基因調(diào)控元件的功能。首先從新鮮采集的肝素抗凝山羊血中提取山羊基因組DNA，PCR擴(kuò)增其3’和5’調(diào)控元件進(jìn)行測(cè)序并分別雙酶切插入打靶載體pLOXP

3、Ⅱ的SalⅠ/ClaⅠ與NotⅠ/XhoⅠ多克隆位點(diǎn)，得到的載體命名為pL5。然后將GFP序列通過(guò)XhoⅠ單酶切插入pL5載體的XhoⅠ多克隆位點(diǎn)，得到的載體命名為pGFP。將載體pGFP通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Bcap-37細(xì)胞，6小時(shí)后換液去除脂質(zhì)體并加入10％胎牛血清，轉(zhuǎn)染后36小時(shí)在熒光顯微鏡觀察。測(cè)序結(jié)果表明PCR擴(kuò)增得到的山羊β-酪蛋白基因的3’和5’端調(diào)控元件序列，與GenBank中公布的相應(yīng)序列同源性在99.5％以上，可以作為基

4、因打靶載體的兩側(cè)同源臂使用。pGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組，證明克隆的山羊β-酪蛋白基因3’與5’調(diào)控元件具有在細(xì)胞水平指導(dǎo)外源基因表達(dá)的生物學(xué)活性。
　　 2.山羊GH基因乳腺特異性打靶載體pLG的構(gòu)建及其生物學(xué)功能驗(yàn)證
　　 將GH cDNA酶切插入pLG載體XhoⅠ多克隆位點(diǎn)，得到GH基因乳腺特異性打靶載體并將其命名為pLG。構(gòu)建的乳腺特異性基因打靶載體pLG質(zhì)粒采用月旨質(zhì)體法，分別導(dǎo)入人乳腺癌細(xì)胞B

5、cap-37和泌乳期山羊乳腺，轉(zhuǎn)染后提取細(xì)胞裂解液和乳腺組織，采用RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)GH轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。結(jié)果顯示與空白組相比，轉(zhuǎn)染pLG質(zhì)粒組在細(xì)胞(P＜0.01)和乳腺組織中(P＜0.05)GH轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量均顯著提高，表明載體pLG可在乳腺細(xì)胞上和乳腺組織中成功轉(zhuǎn)錄和表達(dá)GH。試驗(yàn)結(jié)果顯示構(gòu)建的山羊GH基因乳腺特異性打靶載體可以應(yīng)用到后續(xù)的轉(zhuǎn)GH基因奶山羊生產(chǎn)研究中。
　　 3.山羊GH基因乳腺特異性打靶

6、載體pLG轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞和細(xì)胞篩選
　　 將pLG質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后36h加入G418(600ng/mL)進(jìn)行正篩選，10d后山羊胎兒成纖維細(xì)胞出現(xiàn)明顯單克隆集落。將G418濃度降至300ng/mL并加入丙氧鳥(niǎo)苷(4umoL/mL)負(fù)篩選，7d后挑取單克隆集落消化傳代至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行連續(xù)擴(kuò)培，擴(kuò)培至6孔板后提取單克隆基因組DNA并凍存細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果表明共篩選到36個(gè)單克隆細(xì)胞株，PCR檢