極地微生物抑制植物病原真菌活性菌株的篩選及代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、極地具有獨(dú)特的地理、氣候及環(huán)境特征，造就了極地微生物的新穎性和多樣性，使其在科學(xué)研究、應(yīng)用開發(fā)等方面具有重要的價(jià)值，利用極地微生物篩選抑制植物病原真菌的活性菌株和活性代謝物，可成為植物病害防治潛在的新途徑。本研究將為極地微生物及其活性產(chǎn)物在生態(tài)農(nóng)業(yè)中的推廣和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 本論文以實(shí)驗(yàn)室保存的極地微生物為對(duì)象，篩選具有抑制植物病原真菌活性的菌株，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析；對(duì)篩選獲得菌株P(guān)seudomonas sp.P4-1

2、1發(fā)酵條件優(yōu)化、毒理學(xué)試驗(yàn)、大棚內(nèi)防效試驗(yàn)以及產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的性質(zhì)、分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌機(jī)理等進(jìn)行了研究。
　　 以尖刀鐮孢菌(Fusarium oxysporum)為指示菌，采用平板擴(kuò)散法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的730株南極細(xì)菌進(jìn)行了抗菌活性菌株的篩選，共獲得了12株具有抑菌活性強(qiáng)且活性穩(wěn)定的菌株。16S rRNA種屬鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析的結(jié)果表明,7株活性菌株屬于假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、2株屬于嗜冷桿菌

3、屬(Psychrobacter)、2株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)、1株屬于倫黑墨氏菌屬(Rheinheimera)。抑菌譜的測定結(jié)果表明，不同活性菌株的抑菌譜有所不同，12株活性菌株對(duì)尖刀鐮孢菌、辣椒疫霉(Phytophthora copsici)、大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)和瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)均有一定的抑制作用，而對(duì)葡枝根霉(Rhizopus stolo

4、nifer)均沒有抑制作用；除菌株P(guān)seudoalteromonas sp.1-Z11、Pseudoalteromonas sp.1-Z18、Pseudoalteromonas sp.4-Z11、Psychrobacter sp.4-Z18、Pseudoalteromonas sp.IS-010-07-1、Pseudoalteromonas sp.P3-11-10-1和Pseudoalteromonas sp.Z18-3外，其余5株菌對(duì)

5、水稻紋枯病菌(Rhizoctonia solani)均有抑制作用。菌株P(guān)seudomonas sp.P4-11的抑菌效果均要優(yōu)于其他菌株，作為下一步研究菌株。
　　 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株P(guān)seudomonas sp.P4-11抑菌活性的發(fā)酵條件的結(jié)果表明，菌株最適發(fā)酵條件為：麩皮 0.9134％，酵母粉 0.6485％，鹽度 1.25‰，培養(yǎng)溫度 13 ℃，初始pH值 8.75，裝液量為80 mL/250 mL，接種量為1％。在優(yōu)化

6、后的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下培養(yǎng)120 h，測得的抑菌圈直徑為31.50 mm，比優(yōu)化前(27.25 mm)提高了15.60 ％。
　　 菌株P(guān)seudomonas sp.P4-11的發(fā)酵液毒理學(xué)試驗(yàn)的結(jié)果表明，大鼠急性經(jīng)皮、急性經(jīng)口毒性等級(jí)為低毒，對(duì)孔雀魚未見異常。大棚內(nèi)盆栽防效試驗(yàn)表明，Pseudomonas sp.P4-11發(fā)酵液的1:1稀釋液對(duì)黃瓜白粉病的防治效果為68.26％，1:2稀釋液的防治效果為66.57％，均高于1％

7、武夷菌素水劑500倍稀釋液63.71％的防效。
　　 菌株P(guān)seudomonas sp.P4-11活性物質(zhì)的穩(wěn)定特性的研究結(jié)果表明，發(fā)酵液抑菌活性對(duì)保存時(shí)間(0-8周)、溫度(30 ℃-60 ℃)、pH(6.0-11.0)值都具有良好的穩(wěn)定性，產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)為一類中等極性的物質(zhì)。通過抑菌活性追蹤檢測，采用乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析法、高效液相色譜法，對(duì)菌株P(guān)seudomonas sp.P4-11發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純

8、化，獲得3個(gè)純度較高且具明顯抑菌效果的化合物(T2-20-7-11-5、T2-20-7-11-6、T2-20-7-11-7)。利用質(zhì)譜(MS)、核磁共振氫譜(1H NMR)/碳譜(13C NMR)等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果表明，化合物T2-20-7-11-5和T2-20-7-11-7均為壬基酚聚氧乙烯醚類化合物。
　　 掃描電鏡觀察化合物T2-20-7-11-5對(duì)尖刀鐮孢菌孢子超微結(jié)構(gòu)變化影響的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該化合物可使尖刀鐮孢