獼猴桃ACO基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)研究.pdf

1、獼猴桃由于營(yíng)養(yǎng)成分豐富，特別是維生素含量高，被譽(yù)為水果之王，深受人們的喜歡，具有較好的市場(chǎng)前景。但由于獼猴桃果實(shí)是一種呼吸躍變型果實(shí)，不耐貯藏，在貯運(yùn)過(guò)程中果實(shí)易衰老軟化，失去其應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給生產(chǎn)和銷售帶來(lái)很大的困難。呼吸躍變的產(chǎn)生是由于在貯藏過(guò)程中大量合成乙烯，并產(chǎn)生一系列的生理生化變化所導(dǎo)致的。乙烯是重要的植物成熟激素，調(diào)控果實(shí)的成熟衰老過(guò)程，通過(guò)降低果實(shí)內(nèi)源乙烯的合成，是延長(zhǎng)果實(shí)貯藏保鮮的最有效途徑。在控制內(nèi)源乙烯生物合成的措

2、施中，反義RNA技術(shù)是一種最有效的途徑之一，利用反義RNA技術(shù)抑制乙烯合成的重要限速酶ACC氧化酶的基因表達(dá)，將會(huì)有效降低乙烯的內(nèi)源合成。本研究以海沃德獼猴桃為試材，通過(guò)ACO基因的克隆、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的研究，取得如下主要結(jié)果:
　　 1.成功克隆了獼猴桃ACO基因。利用已登錄其他植物的ACO基因序列合成特異引物，擴(kuò)增并克隆了獼猴桃ACO基因的全長(zhǎng)cDNA序列，該基因cDNA序列全長(zhǎng)1003bp，其CDS為

3、960bp，編碼319個(gè)氨基酸殘基，該cDNA序列與其它已登錄植物的ACO基因的序列同源性高，最高達(dá)94％，具有7個(gè)保守區(qū)序列及ACO基因的其他序列特點(diǎn)和生化特征，確定為ACO基因(GenBank登錄號(hào):JQ062390)。
　　 2.構(gòu)建了海沃德獼猴桃ACC氧化酶基因反義表達(dá)載體。分別將擴(kuò)增得到的ACO基因和pCAMBIA1300雙酶切后，用T4DNA連接酶連接，成功構(gòu)建了ACO基因的反義表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EH

4、A105，經(jīng)質(zhì)粒提取和PCR檢測(cè)，該反義表達(dá)載體構(gòu)建成功并已轉(zhuǎn)化EHA105，為下一步遺傳轉(zhuǎn)化研究提供了轉(zhuǎn)化工具。
　　 3.優(yōu)化了獼猴桃的組織培養(yǎng)體系。該體系的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+6-BA(10mg/L)+NAA(0.2mg/L)+TDZ(0.2mg/L);繼代培養(yǎng)基為:MS+6-BA(0.25mg/L)+NAA(1mg/L)。葉片接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，7天左右可以看到葉脈及葉片邊緣處開(kāi)始膨大，愈傷開(kāi)始生長(zhǎng)，獼猴桃葉片愈傷誘導(dǎo)率

5、為100％，20天左右可以繼代一次。
　　 4.建立了高效、穩(wěn)定的遺傳再生體系。選取米良一號(hào)優(yōu)良單株上無(wú)病蟲(chóng)害的1年生硬枝培育成的無(wú)菌苗葉片，在含潮霉素等抗生素的篩選培養(yǎng)基YS:MS+6-BA(0.25mg/L)+NAA(1mg/L)+頭孢霉素500mg/L+羧芐青霉素400mg/L+潮霉素20mg/L，pH6.0.MS上誘導(dǎo)分化和生根，侵染時(shí)農(nóng)桿菌的OD值為0.6時(shí)，愈傷組織浸入菌液中30min，每隔5min搖一次。25～26

6、℃下暗培養(yǎng)3～4d，侵染效果較為理想，成功將RNAi基因轉(zhuǎn)化到離體培養(yǎng)的獼猴桃葉片中，并用PCR檢測(cè)技術(shù)，對(duì)轉(zhuǎn)化后的植株進(jìn)行了鑒定，得到的陽(yáng)性植株率為71％。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，再生苗ACO基因的表達(dá)量低于野生型81％。
　　 5.為了陽(yáng)性優(yōu)良再生植株后續(xù)推擴(kuò)生產(chǎn)，對(duì)嫁接時(shí)砧木的影響進(jìn)行了分析。以普通、高抗3號(hào)兩種砧木和獼猴桃良種米良1號(hào)、紅陽(yáng)及翠玉為試材，研究砧木對(duì)各品種果實(shí)品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與普通砧木相比，高