荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-防御素mRNA的表達(dá)及可能信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、防御素是一種富含精氨酸的陽(yáng)離子低分子短肽，對(duì)G+、G-菌，真菌、包膜病毒和螺旋體等都有廣譜的殺傷作用。它不僅是新型高效的抗菌多肽，能直接殺菌，抵御入侵機(jī)體的病原微生物，而且能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、調(diào)節(jié)組織創(chuàng)傷修復(fù)、在介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)過(guò)程中起著重要作用。防御素是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)防御系統(tǒng)中重要的成員，提示防御素可能在奶牛乳腺中抵抗微生物感染、維持乳腺健康方面起著至關(guān)重要的作用。在奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)，防御素應(yīng)參與了乳腺的防御過(guò)程，但防御素產(chǎn)生了怎樣的變

2、化，在變化的過(guò)程中又是如何調(diào)控的仍不清楚。
　　目前防御素在抗乳腺炎和其防御機(jī)制方面的研究報(bào)道非常少，而關(guān)于β-防御素抗乳腺炎的作用過(guò)程更是少之又少，也未見(jiàn)其在奶牛乳腺中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制方面的研究。為此我們初步研究了β-防御素基因在奶牛乳腺的表達(dá)情況和LPS誘導(dǎo)時(shí)β-防御素基因的表達(dá)變化及其可能調(diào)控的信號(hào)通路。其結(jié)果如下：
　　1、克隆了奶牛乳腺組織EBD、TAP、LAP、BNBD4、BNBD5和BNBD7基因。以奶牛乳腺組織

3、為材料，提取乳腺組織總RNA，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中牛β-防御素cDNA的保守序列分別設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增基因片段，純化后連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌后挑取陽(yáng)性重組質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí) EBD、TAP、LAP、BNBD4、BNBD5和BNBD7在奶牛乳腺組織有表達(dá)。
　　2、建立穩(wěn)定的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系，并確定乳腺上皮細(xì)胞6種β-防御素基因的表達(dá)情況。采用膠原酶消化法和胰蛋白酶選擇性消化法對(duì)奶牛

4、乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)和純化。對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)以及傳1代細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。經(jīng)形態(tài)學(xué)、核型分析和運(yùn)用RT-PCR方法檢測(cè)α-酪蛋白基因的表達(dá)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)等方法對(duì)所培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。在成功培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，提取乳腺上皮細(xì)胞總RNA，運(yùn)用RT-PCR方法擴(kuò)增6種β-防御素（EBD、BNBD4、BNBD5、BNBD7、LAP、T

5、AP），測(cè)序結(jié)果證明6種β-防御素基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞有表達(dá)。
　　3、獲得奶牛乳腺組織與乳腺上皮細(xì)胞6種β-防御素mRNA的基礎(chǔ)表達(dá)水平。通過(guò)RT-qPCR方法對(duì)6種β-防御素進(jìn)行擴(kuò)增及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，乳腺組織中6種β-防御素基因的相對(duì)表達(dá)量有顯著性差異（P<0.01），僅BNBD4與BNBD5之間的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異，其中LAP相對(duì)表達(dá)量最多，BNBD7、EBD、BNBD5、BNBD4次之，TAP的相對(duì)表達(dá)量最

6、低。奶牛乳腺上皮細(xì)胞中6種β-防御素基因mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量有顯著性差異（P<0.01），僅EBD與BNBD4之間的相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異，其中LAP相對(duì)表達(dá)量最多，BNBD7、BNBD5、BNBD4、EBD次之，TAP的相對(duì)表達(dá)量最低。
　　4、為了研究乳腺上皮細(xì)胞中6種β-防御素mRNA表達(dá)水平，我們培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞，添加代表大腸桿菌為主要侵染力的脂多糖（LPS）建立試驗(yàn)性乳腺炎的乳腺上皮細(xì)胞模型。首先，確定了最佳的傳1

7、代細(xì)胞來(lái)研究6種β-防御素的表達(dá)變化。然后在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中添加不同劑量（50、100、200、400、800 ng/ml）LPS處理不同時(shí)間（2、4、8、16、24、48、72h），采用實(shí)時(shí)RT-qPCR方法檢測(cè)乳腺上皮細(xì)胞中6種β-防御素mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明：①乳腺上皮細(xì)胞中6種β-防御素mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組相比存在一定的劑量和時(shí)間效應(yīng)，有些隨著濃度增加而表達(dá)量增高，如LAP，這可能與其基礎(chǔ)表達(dá)量有關(guān)；在時(shí)間上總體趨

8、勢(shì)是當(dāng)LPS誘導(dǎo)后主要在8h、48h與72h時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到高值，在2h、4h、16h和24h表達(dá)量相對(duì)較低，推測(cè)與其信號(hào)通路基因的調(diào)控時(shí)間相關(guān)。②LAP表達(dá)量差異較大，增加幅度較高，在奶牛乳腺防御中起重要的防御作用。③乳腺上皮細(xì)胞中6種β-防御素mRNA的表達(dá)量都顯著增加，表明6種β-防御素的表達(dá)都呈誘導(dǎo)型表達(dá)。
　　5、確定奶牛乳腺上皮細(xì)胞中是否有TLR2、TLR4、NF-κB P65、CREB表達(dá)，根據(jù)已發(fā)表的基因各自序列設(shè)

9、計(jì)特異性引物，經(jīng)RT-PCR鑒定及測(cè)序證明4種基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞可表達(dá)。然后采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)4個(gè)基因mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果表明：①LPS刺激后TLRs中TLR2與TLR4的介導(dǎo)作用中，TLR2主要在4h時(shí)起介導(dǎo)作用，在2h、8h和48h起部分調(diào)控作用；TLR4在除4h外的幾個(gè)時(shí)間段起主要的介導(dǎo)作用。②TLR2與TLR4都介導(dǎo)了LPS刺激時(shí)的調(diào)控過(guò)程，在整個(gè)調(diào)控過(guò)程中以TLR4起主要介導(dǎo)作用。③CREB在與NF-κB并行的

10、信號(hào)通路中，CREB和核因子NF-κB都參與了炎癥的調(diào)控過(guò)程。④在調(diào)控過(guò)程中CREB主要在8h時(shí)起調(diào)節(jié)作用，NF-κB在各時(shí)段都有顯著性差異，調(diào)控增幅較大。⑤脂多糖對(duì)于4種調(diào)控因子的表達(dá)量都有促進(jìn)作用。
　　6、為了進(jìn)一步確定NF-κB途徑是否為脂多糖誘導(dǎo)防御素表達(dá)的信號(hào)通路之一，我們?cè)趥?代乳腺上皮細(xì)胞添加特異性抑制劑PDTC以阻斷NF-κB信號(hào)通路，然后采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)BNBD5、BNBD7、TAP、LAP、EBD和