GRK2基因在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、奶牛乳腺泌乳時期最主要的生理活動是乳生成和乳分泌，其受各種基因調(diào)控和各種因素影響。為發(fā)現(xiàn)不同泌乳性狀的奶牛乳腺差異表達(dá)基因，揭示調(diào)控乳生成和乳品質(zhì)的相關(guān)分子過程和生理活動，本研究采用數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling，DGE)技術(shù)對不同乳品質(zhì)和不同乳腺發(fā)育時期的荷斯坦奶牛乳腺基因進(jìn)行檢測，構(gòu)建不同狀態(tài)下乳腺的基因表達(dá)譜，使用熒光定量RT-PCR檢驗DGE的準(zhǔn)確性，并對差異表達(dá)基因進(jìn)行(Ge

2、neOntology) GO注釋。從基因差異表達(dá)譜中篩選出基因GRK2，利用基因過表達(dá)和siRNA干擾技術(shù)，改變GRK2在乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過Western blotting技術(shù)檢測GRK2過表達(dá)和基因沉默后，乳腺上皮細(xì)胞中相關(guān)泌乳調(diào)控基因的蛋白表達(dá)量變化，推斷GRK2對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響。
　　 DGE檢測構(gòu)建了高乳品質(zhì)泌乳期奶牛（H組）、低乳品質(zhì)泌乳期奶牛（L組）和干乳期奶牛（P組）乳腺基因表達(dá)譜，篩選

3、出不同泌乳性狀和不同生理狀態(tài)下奶牛乳腺的差異表達(dá)基因。熒光定量RT-PCR檢測了從DGE結(jié)果篩選出的22個差異表達(dá)的重要泌乳調(diào)控關(guān)鍵基因，并與DGE相比較，結(jié)果證明DGE準(zhǔn)確性和可信度很高。
　　 基因表達(dá)譜分析結(jié)果表明，高乳品質(zhì)泌乳期奶牛相對于低乳品質(zhì)泌乳期奶牛乳腺組織共有205個差異表達(dá)基因，其中139個高表達(dá)基因，66個低表達(dá)基因;而高乳品質(zhì)泌乳期奶牛與干乳期奶牛乳腺組織基因相比，有741個差異表達(dá)基因，214個高表達(dá)，5

4、27個低表達(dá);低乳品質(zhì)泌乳期奶牛與干乳期奶牛乳腺基因相比之下，上調(diào)基因294個，而下調(diào)基因達(dá)749個。根據(jù)結(jié)果統(tǒng)計，H組奶牛相對于L組和P組奶牛乳腺組織都差異表達(dá)的基因有49個，P組奶牛相對于H組和L組奶牛乳腺組織都差異表達(dá)的基因有446個，L組奶牛相對于H組和P組奶牛乳腺組織差異表達(dá)的基因117個。
　　 GO分析結(jié)果顯示，高乳品質(zhì)泌乳期奶牛乳腺的相關(guān)差異表達(dá)基因，很大程度上與其所處的生理狀態(tài)有關(guān)，其乳蛋白生成、乳糖乳脂代謝、

5、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)等功能基因數(shù)目相對較多。而干乳期奶牛乳腺差異表達(dá)基因主要集中于細(xì)胞增殖、新陳代謝等功能，可能該狀態(tài)下的乳腺在為泌乳期做好充分泌乳準(zhǔn)備。
　　 GRK2基因過表達(dá)和基因沉默結(jié)果表明，GRK2可抑制β-酪蛋白、STAT5、mTOR、p-mTOR、AKT1、p-AKT1、S6K1、p-S6K1、ELF5基因的表達(dá)，提高M(jìn)APK1、p-MAPK1、Cyclin D1基因的表達(dá)。說明GRK2基因?qū)θ榈鞍缀铣删哂酗@著抑制作用，降低