番茄枯萎病和梨輪紋病生防菌控病機制研究及幾丁質酶基因的克隆與表達.pdf

1、由尖孢鐮刀菌番茄?；蚚Fusarium oxysporum f.sp.licopersici(saec) snyderetHansen]引起的番茄枯萎病和貝倫格葡萄座腔菌梨生專化型Botryosphaeriaberengeriana de.Not.f.sp.piricola(Nose)引起的梨輪紋病全國普遍發(fā)生。生物防治植物病害能降低農產品表面化學殺菌劑的殘留量，保護生態(tài)環(huán)境和人類健康。
　　 我們采集不同地區(qū)樣本，以兩種病原

2、菌為靶標菌，分離、篩選對枯萎病菌或輪紋病菌具有很強拮抗作用的菌株，進行種屬鑒定。初步研究拮抗細菌產生的抑茵物質及控病促生作用機制，克隆生防相關基因．幾丁質酶基因。同時還研究了拮抗菌株之間互作、微生物．化學物質（殺菌劑、NaHC03）協同作用與防效之間的相關性。研究結果表明：
　　 1、22株拮抗細菌對番茄枯萎病菌具有較強的室內抑制作用，其中菌株PTS-394、H-70、L-1和SJ-280抑制率最高；22株細菌均能分泌蛋白酶；其

3、中菌株C8-8能分泌幾丁質酶；有3株細菌能分泌纖維素酶；3株細菌能分泌嗜鐵素。盆栽試驗結果表明：拮抗細菌PTS-394對番茄枯萎病的防效最高，為77.40％;菌株H-70、L-1和SJ-280對番茄枯萎病的防效均大于60%。對上述四株拮抗細菌進行16s rRNA種屬鑒定，均為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
　　 2、利用PCR方法從菌株C8-8中克隆到編碼幾丁質酶的chiA基因。同源性比對發(fā)現該基因序列與粘

4、質沙雷氏菌的chiA有97%以上的相似性。酶切后連接到質粒28a中，并轉化大腸桿菌DH5c~，擴增培養(yǎng)后提取質粒28a(chiA)并轉入到表達宿主大腸桿菌DH3中。DH3ChiA菌株在幾丁質培養(yǎng)基上能產生透明的水解圈，具有幾丁質酶活性，超聲波破碎后SDS-PAGE電泳顯示為一條相對分子質量約為60KDa的蛋白質，該蛋白具有較強的室內抑菌活性。
　　 3、拮抗細菌C8-8的最適培養(yǎng)溫度為30℃-35℃、最適培養(yǎng)pH值為7.0-8.

5、0。培養(yǎng)時間、初始接種量對菌株C8-8的生長有明顯的影響，培養(yǎng)27h后菌液OD值最高；最佳初始接種量應是被接種培養(yǎng)液體積的0.5-1/300。不同通氣量對菌株生長無明顯影響。不同培養(yǎng)條件（碳源、氮源、誘導物、溫度、時間和pH值）下菌株C8-8產幾丁質酶的活力差別較大。N-乙酰氨基葡萄糖能完全抑制菌株C8-8產酶；酵母粉和蛋白胨能使菌株C8-8酶活力明顯提高；膠體幾丁質能誘導菌株C8-8產酶。培養(yǎng)溫度為31℃，pH值為7.3，培養(yǎng)6天時菌

6、株C8-8的酶活最高，為485μg GlcNAc·h-1。
　　 4、接種菌株C8-8能誘導番茄植株產生抗性效應，提高植株體內苯丙氨酸解氨酶(PAL)和過氧化物酶(POD)的酶活性；而且還有利于積累活性氧，進一步激發(fā)寄主抗性。采用高效液相色譜HPLC對菌株C8-8代謝產物分析表明：該菌株C8-8在NA培養(yǎng)基中的代謝產物內存在大量的產生GA3，推測可能和促生作用相關，培養(yǎng)2d后產生的GA3為158mg/1，而IAA未測出。在基本培

7、養(yǎng)基中該菌株代謝產物未檢測出IAA和GA3。
　　 5、拮抗細菌之間存在多種互作關系。當混合的2個菌株之間互作關系是親和的，其生防效果有所提高，如親和性菌株組合SJ-280+PTS394對番茄枯萎病的防效為47.1%，明顯好于單菌株SJ-280(35.3%)和PTS394(38.7%)的防效。當混合的2個菌株之間互作關系是不親和的，有的菌株組合生防效果下降，如不親和性菌株組合C8-8+ PTS394的防效為23.5%，明顯低于單

8、菌株C8-8(52.8%)和PTS394(38.7%)的防效；有的菌株組合生防效果提高，如不親和性菌株組合L-I+PTS394的防效為50.0%，明顯好于單菌株L-1(29.4%)和PTS394(38.7%)的防效。
　　 6、分離樣本，獲得21株對梨輪紋病菌茵絲生長有較強的拮抗能力的菌株，其中拮抗性能最好的細菌sf628抑菌圈直徑達45 mm，抑制率達59.21%。梨果接種試驗結果表明：21株拮抗能力較強的細菌中有5株拮抗細菌

9、對梨輪紋病菌引起的病斑擴展抑制率大于50%，其中菌株sf628抑制率述60.61%。進一步的理化特性和分子鑒定結果表明，菌株sf628為枯草芽孢桿菌枯草亞種。
　　 7、常見26種化學藥劑對梨輪紋病菌的室內毒力測定結果表明：25%敵力脫能有效抑制梨輪紋病菌菌絲生長，ECso值為0.1522μg/ml.將拮抗細菌sf628與25%敵力脫進行復配，結果表明配比為1:3，1:2、1:1、2:1時增效比均大于1.5，表明有增效作用。其中

10、配比為1:3時對梨輪紋病菌的毒力最強，增效比為2.942。拮抗細菌sf628與25%敵力脫配比為3:1時，增效比為1.071，表明兩種單劑復配后有相加作用。
　　 8、室內抑菌試驗結果表明：生防菌單劑對梨輪紋病菌的防效為75.77-85.41%;與NaHC03協同作用后防效提高，為83.00-90.23%。以生防茵11為例，梨果試驗結果表明：先接種病菌再噴施生防茵時，對梨輪紋病的防效為23.83%;與NaHC03協同作用后防效提