枯草芽胞桿菌R31對(duì)香蕉枯萎病生防機(jī)制研究.pdf

1、枯草芽胞桿菌R31菌株是一株從石斛蘭葉片中分離到的內(nèi)生菌，前期已完成R31的生物特性、規(guī)?；l(fā)酵技術(shù)研究和大田香蕉枯萎病防治效果測(cè)定，本論文在此基礎(chǔ)上開(kāi)展生防機(jī)理研究，為該菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。首先通過(guò)盆栽試驗(yàn)再次確定菌株的防效，然后對(duì)菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)開(kāi)展定性研究，檢查R31產(chǎn)生的抗病酶、揮發(fā)性拮抗物質(zhì)、發(fā)酵上清液的抑菌活性、脂肽及其抑菌效果、拮抗蛋白及其抑菌效果等，發(fā)現(xiàn)R31產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)活性和穩(wěn)定性不高，不能解釋R31的生防效果。

2、然后從R31的定殖能力著手，發(fā)現(xiàn)R31具有在香蕉和粉蕉根際和根圍長(zhǎng)期定殖的能力，并發(fā)現(xiàn)R31在液體表面和固體表面具有形成菌膜的能力，這種能力受到香蕉枯萎病毒素的影響，最后利用綠色熒光蛋白標(biāo)記R31，研究了熒光標(biāo)記菌株的穩(wěn)定性及其在香蕉根系定殖的情況。結(jié)果如下：
　　 (1)R31全發(fā)酵液防治香蕉枯萎病的盆栽試驗(yàn)：R31 NB發(fā)酵液對(duì)溫室盆栽香蕉枯萎病的防治效果為74.19%。
　　 (2)R31產(chǎn)拮抗物質(zhì)的定性研究：R3

3、1不產(chǎn)揮發(fā)性拮抗物質(zhì)；R31能在以幾丁質(zhì)為唯一碳氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但通過(guò)DNS法檢測(cè)不到發(fā)酵液和破壁細(xì)胞有幾丁質(zhì)酶活力；R31在玉米豆粕培養(yǎng)基中發(fā)酵，無(wú)菌發(fā)酵液有蛋白酶活力，但在NB和香蕉組織浸提液培養(yǎng)液中未能檢測(cè)出蛋白酶活力。
　　 (3)R31發(fā)酵上清的抑菌效果：比較R31在NB培養(yǎng)基發(fā)酵24 h、48 h、72 h的上清液對(duì)香蕉枯萎病4號(hào)生理小種FOC009菌株的抑制作用，發(fā)現(xiàn)48 h發(fā)酵上清對(duì)FOC009的抑制率最高，

4、為16.87%，測(cè)定發(fā)現(xiàn)溫度和pH對(duì)上清液的拮抗活性有顯著影響，40℃以上的溫度顯著降低發(fā)酵上清的抑菌率，高于或低于發(fā)酵液本身的pH(8.75)均顯著降低發(fā)酵液的抑菌率。
　　 (4)R31發(fā)酵上清中拮抗蛋白的研究：將R31發(fā)酵上清用不同濃度的飽和硫酸銨沉淀，發(fā)現(xiàn)每種濃度硫酸銨沉淀的蛋白對(duì)FOC009都有一定的抑制效果，以90%硫酸銨抑制率最高，為31.32%。沸水浴和蛋白酶K處理后90%硫酸銨沉淀的拮抗蛋白對(duì)FOC009的抑制

5、作用并沒(méi)有顯著減弱。SDS-PAGE的結(jié)果顯示，90%硫酸銨沉淀蛋白條帶最多，其中最亮的條帶分子量為29kD和66.4kD左右。
　　 (5)發(fā)酵上清中脂肽的研究：R31發(fā)酵上清液經(jīng)酸沉淀制備的脂肽粗提物對(duì)FOC009的抑制率為32.04%，經(jīng)過(guò)純化后對(duì)FOC009的抑制率提高為34.47%。抽提的脂肽有溶血活性、排油能力和使液滴坍塌的能力，表明脂肽中含有表面活性素。設(shè)計(jì)引物從R31的基因組中克隆了表面活性劑合成必需基因sfp，

6、從基因水平證明R31產(chǎn)生表面活性劑。
　　 (6)R31在香蕉根系的定殖能力研究：對(duì)R31進(jìn)行抗生素標(biāo)記，用盆栽灌根接種測(cè)定其在巴西蕉和廣粉一號(hào)粉蕉根際的定殖能力。每株苗接種50 ml1.78×108cfu/ml的菌液，60 d后，標(biāo)記菌株在香蕉根際土、根表、根內(nèi)和球莖中的含量分別為4.14×106cfu/g(干重)、1.09×107 cfu/g(鮮重)、4.66×104cfu/g(鮮重)、1.23×103cfu/g(鮮重)；同

7、樣處理的粉蕉40 d后，根際土和根表的菌量分別為9.87×105cfu/g(干重)，7.9×104cfu/g(鮮重)。結(jié)果顯示抗生素標(biāo)記菌株R31*在根際土和根表能成功定殖，但在根內(nèi)和球莖的定殖量則較少，且根際土和根表的定殖量與接種濃度和每日最高氣溫有關(guān)。
　　 (7)R31生物薄膜形成能力測(cè)定：發(fā)現(xiàn)R31能夠在微量滴定板壁形成明顯的生物薄膜，香蕉枯萎病菌產(chǎn)生的毒素能夠?qū)31形成生物薄膜產(chǎn)生負(fù)面影響。
　　 (8)綠色