抗枯萎病香蕉種質(zhì)的挖掘及其抗病相關(guān)基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、香蕉枯萎病是世界香蕉生產(chǎn)的毀滅性病害，要消除香蕉枯萎病等病害對(duì)香蕉產(chǎn)業(yè)的威脅，根本出路在于培育抗病的品種。鑒于栽培香蕉主要是不結(jié)實(shí)的三倍體或多培體及其傳統(tǒng)育種的艱難，香蕉抗病育種的突破寄希望于生物技術(shù)育種。而挖掘各種香蕉的抗病基因資源，克隆抗病基因是進(jìn)行香蕉遺傳改良的重要基礎(chǔ)。 本研究首先利用基于rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的PCR-RFLP標(biāo)記和RAPD技術(shù)對(duì)采自深圳的三種野生蕉遺傳多樣性進(jìn)行了分析，并采用三個(gè)已報(bào)道與香蕉枯

2、萎病相關(guān)的RAPD標(biāo)記及苗期接種鑒定對(duì)其枯萎病的抗性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明野生蕉1號(hào)和3號(hào)為AA基因型：野生蕉2號(hào)為BB基因型。在遺傳相似性系數(shù)為0.32處，可將同屬．AA基因型的野生蕉1號(hào)和3號(hào)，與貢蕉(AA)和巴西蕉(AAA)聚為一類；基因型為BB的野生蕉2號(hào)，與基因型為ABB的粉蕉和大蕉聚為一類。與香蕉枯萎病相關(guān)的RAPD標(biāo)記分析以及香蕉枯萎病早期診斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明野生蕉2號(hào)和3號(hào)感香蕉枯萎病，而野生蕉1號(hào)抗病。 采用同

3、源序列克隆法分離野生蕉1號(hào)抗病基因類似序列。根據(jù)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding site，NBS)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域(serine/threonine kinase domain)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，以野生蕉1號(hào)(Musa acuminata cv.Shenzhen 1(AA))葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，獲得了6個(gè)500bp左右的RGAs片段。其中有兩個(gè)RGAs(WNB1和

4、WNB2)具有NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域特征，并且WNB1具有連續(xù)的ORF。其余4個(gè)RGAs(WST1，WST2，WST3和WST4)均具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶域特征，且LWST3編碼的氨基酸序列與水稻抗葉斑病基因Xa21同源性很高。用半定量PCR分析枯萎病菌誘導(dǎo)后野生蕉葉片中RGAs的表達(dá)情況，結(jié)果表明WNB1和WST3受枯萎病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量增強(qiáng)，這表明WNB1和WST3的表達(dá)可能與香蕉枯萎病抗性相關(guān)。 木質(zhì)素作為細(xì)胞阻止病原入

5、侵的第一道保護(hù)屏障，在植物防衛(wèi)反應(yīng)中起著重要作用，而苯丙氨酸解氨酶作為木質(zhì)素合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其作用非常重要。為了研究苯丙氨酸解氨酶基因在大蕉與枯萎病菌互作中的作用，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了大蕉苯丙氨酸解氨酶基因全長(zhǎng)cDNA。此cDNA長(zhǎng)1300 bp，包含一個(gè)長(zhǎng)為1191 bp，編碼397個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框(ORF)，推導(dǎo)的氨基酸序列與水稻PAL基因氨基酸序列同源性達(dá)89％，將此基因命名為M-PAL．