糞類圓線蟲RIOK-1蛋白激酶基因的結(jié)構(gòu)和功能研究.pdf

1、寄生線蟲給畜牧業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失并且嚴(yán)重危害人類健康，全球至少有1億人口感染了寄生線蟲。在畜牧業(yè)上僅僅捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，就造成了全球性的數(shù)以百萬的羊感染，并且每年造成近乎100億美元的經(jīng)濟(jì)損失。目前控制寄生線蟲感染的方法僅限于化學(xué)藥物，并且過分的依賴于早期研發(fā)的數(shù)量有限的幾種藥物。由于大量，長期的使用藥物，已經(jīng)誘導(dǎo)寄生線蟲抗藥性的產(chǎn)生。由于寄生線蟲生活史復(fù)雜，宿主多樣并且具有逃避宿主免疫的機(jī)制，使疫苗和抗寄生蟲藥物研發(fā)十分緩慢。新型藥物以及

2、疫苗的研發(fā)需要對寄生蟲發(fā)育過程中必需基因的功能進(jìn)行深入研究。
　　因此本研究選取了近年來報(bào)道的一類非典型蛋白激酶RIO蛋白激酶家族成員之一，RIOK-1為研究對象，以具有體外生活周期的人畜共患寄生線蟲糞類圓線蟲（Strongyloides stercoralis）為寄生線蟲模型，利用分子生物學(xué)方法和生物信息學(xué)的方法分離了糞類圓線蟲RIOK-1激酶編碼基因Ss-riok-1的cDNA及gDNA序列;分析了該激酶編碼基因在糞類圓線蟲不

3、同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄水平及其重組蛋白Ss-RIOK-1的體外激酶活性;利用轉(zhuǎn)基因的方法分析了Ss-riok-1在幼蟲體內(nèi)的組織學(xué)定位以及該激酶在糞類圓線蟲幼蟲發(fā)育階段的重要功能。
　　(1)糞類圓線蟲RIOK-1編碼基因的結(jié)構(gòu)特征
　　Ss-riok-1的cDNA全長為2056bp，包括CDS1524 bp，編碼507個(gè)氨基酸，5'UTR377bp，3'UTR155 bp。Ss-riok-1的全長基因組序列包括5'UTR，3'U

4、TR和編碼區(qū)一共為6117 bp，其編碼區(qū)含有兩個(gè)內(nèi)含子，長度分別為134 bp和64bp。在Ss-riok-15' UTR內(nèi)也含有兩個(gè)內(nèi)含子，大小分別為711 bp和3148bp。Ss-riok-1的啟動(dòng)子長度為4280 bp，含有真核生物常見的啟動(dòng)子元件。RIOK-1激酶具有該家族保守的RIO激酶功能域，其功能域包括ATP結(jié)合區(qū);可變環(huán);鉸鏈區(qū);催化活性區(qū)和金屬離子結(jié)合區(qū)。與RIO區(qū)域的保守性不同，RIOK-1的N端和C端在不同物種

5、間相似性較低。Ss-RIOK-1在體外具有自磷酸化和磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶通用底物牛髓磷脂蛋白的活性，并且通過突變掉催化位點(diǎn)的天冬氨酸可以使激酶喪失催化活性。
　　(2)糞類圓線蟲RIOK-1激酶編碼基因Ss-riok-1的時(shí)空表達(dá)特征
　　通過Ss-riok-1的轉(zhuǎn)錄水平分析，我們發(fā)現(xiàn)該基因在糞類圓線蟲的所有發(fā)育階段均有轉(zhuǎn)錄，且在感染性三期幼蟲中轉(zhuǎn)錄水平最高。
　　Ss-riok-1在糞類圓線蟲幼蟲體內(nèi)細(xì)胞的胞質(zhì)中

6、有明顯的表達(dá)。其表達(dá)部位主要表現(xiàn)在部分皮下細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞中，主要包括頭部神經(jīng)元，尾部神經(jīng)元以及部分軀體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。Ss-riok-1的表達(dá)形式隨著幼蟲的發(fā)育發(fā)生了變化，從剛孵化的幼蟲的全身性表達(dá)到二期幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)最終在感染性三期幼蟲的肌肉組織中表達(dá)。
　　(3)突變的RIOK-1影響糞類圓線蟲幼蟲的發(fā)育
　　突變的RIOK-1激酶同樣表達(dá)在幼蟲體內(nèi)細(xì)胞的胞質(zhì)中。突變的激酶在蟲卵內(nèi)的表達(dá)導(dǎo)致蟲卵孵化率的下降及該寄生線

7、蟲后自由生活階段二期幼蟲的運(yùn)動(dòng)性的降低，并且造成了從后自由生活階段二期幼蟲到感染性三期幼蟲發(fā)育的缺陷，表現(xiàn)為幼蟲蛻皮的不完全和咽部結(jié)構(gòu)的不完全發(fā)育。
　　(4) Ss-RIOK-1潛在的互作蛋白的初步驗(yàn)證
　　根據(jù)秀麗新桿線蟲基因互作的數(shù)據(jù)庫的預(yù)測和分析，初步選擇了五個(gè)可能與Ss-RIOK-1相互作用的蛋白編碼基因Ss-lin-35、Ss-riok-2、Ss-kin-3、Ss-nob1和Ss-pno1。但是通過酵母雙雜交系統(tǒng)