隱孢子蟲CP15分子疫苗及細(xì)胞因子佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、本試驗(yàn)根據(jù)許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)疫苗可能是防治隱孢子蟲病的有效途徑之一，并且隱孢子蟲子孢子表面蛋白CP15 是該病免疫診斷、免疫預(yù)防和免疫治療的重要靶抗原，可用來研究隱孢子蟲病新型疫苗。設(shè)計(jì)以CP15 為靶抗原研制核酸疫苗，亞單位疫苗和分子免疫佐劑與目的基因串聯(lián)的核酸疫苗，其研究方法：
　　 1.通過基因重組的方法，將隱孢子蟲鼠基因型子孢子表面抗原CP15基因克隆到真核表達(dá)載體pVAX-1 上，并加入CpG-ODN 免疫刺激序列，構(gòu)建

2、重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-CP15和pVAX1-C-CP15。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染Hela 細(xì)胞，并用G418 加壓篩選，RT-PCR 法檢測表明外源基因得到轉(zhuǎn)錄；用間接免疫熒光、SDS-PAGE和Western blot法檢測顯示CP15基因成功表達(dá)。
　　 2．為觀察細(xì)胞因子和CpG-ODN對(duì)隱孢子蟲核酸疫苗的免疫佐劑效應(yīng)，分別將CpG-OND序列與牛IL-18、IFN-γ單獨(dú)或組合與隱孢子蟲鼠基因型子孢

3、子表面蛋白CP15基因串聯(lián)并克隆到真核表達(dá)載體pVAX-1中，構(gòu)建核酸疫苗，免疫BALB/c小鼠，檢測其誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫水平，觀察對(duì)隱孢子蟲感染的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，制備的6個(gè)隱孢子蟲病核酸疫苗免疫BALB/c小鼠后，小鼠血清中特異性抗體IgG滴度隨免疫次數(shù)的增加而增加；CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌水平免疫指標(biāo)均升高；串聯(lián)有牛IL-18、牛IFN-γ、CpG-ODN分子免疫佐劑的核酸疫苗免疫

4、小鼠后各項(xiàng)免疫指標(biāo)與不含有分子免疫佐劑的核酸疫苗相比差異顯著（P<0.05）；牛IL-18、牛IFN-γ分別和CpG-ODN串聯(lián)的雙因子免疫佐劑與牛IL-18、牛IFN-γ和CpG-ODN單免疫佐劑相比能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。感染試驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組排出的隱孢子蟲鼠基因型卵囊量極顯著減少（P<0.01），減卵率達(dá)到87%~100%；首次排卵囊時(shí)間延后；排卵囊持續(xù)時(shí)間縮短。
　　 3.將重組質(zhì)粒pET

5、-28a-CP15在大腸桿菌中成功表達(dá)，Western blot分析表明制備的重組蛋白具有良好的免疫活性，可被隱孢子蟲鼠基因型感染小鼠血清所識(shí)別。將重組蛋白與弗氏佐劑充分乳化后制成亞單位疫苗免疫BALB/c小鼠，對(duì)疫苗誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫水平及對(duì)隱孢子蟲感染的免疫保護(hù)效果進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，免疫小鼠血清中特異性抗體IgG滴度水平隨免疫次數(shù)的增加而增加，呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，在第3次免疫后達(dá)到最高；CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量、T淋巴細(xì)

6、胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞因子分泌水平檢測顯示免疫小鼠的各項(xiàng)免疫指標(biāo)均極顯著高于對(duì)照組（P<0.01）；與對(duì)照組相比，免疫組小鼠卵囊排出量極顯著低于對(duì)照組（P<0.01），減卵率達(dá)到99%，排卵時(shí)間縮短為1 d。
　　 研究結(jié)果表明：制備的核酸疫苗，轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后，目的基因能夠成功的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，并且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫活性；制備的含有牛細(xì)胞因子和CpG-ODN的核酸疫苗免疫小鼠后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子和CpG-ODN對(duì)DNA疫苗具有免疫增強(qiáng)