人源隱孢子蟲(chóng)動(dòng)物模型的建立與隱孢子蟲(chóng)種系發(fā)育關(guān)系分析.pdf

1、隱孢子蟲(chóng)病是一種重要的人獸共患的原蟲(chóng)病，目前尚無(wú)用于治療隱孢子蟲(chóng)病的特效藥物。線粒體是真核生物中擁有蛋白和酶最多的細(xì)胞器，因而隱孢子蟲(chóng)線粒體也可能成為藥物潛在的作用靶位。最近一些研究表明隱孢子蟲(chóng)存在線粒體誘生的細(xì)胞器，但和其他原生動(dòng)物的線粒體存在著差異。隱孢子蟲(chóng)具有退化的線粒體，但缺少線粒體基因組，完全依賴核基因來(lái)編碼所需的功能蛋白。 1.為了評(píng)價(jià)兩種常用免疫抑制方法對(duì)小白鼠排卵囊規(guī)律的影響。作者將19日齡小白鼠隨機(jī)分成兩組，第

2、一組通過(guò)飲水給予地塞米松，第二組采用導(dǎo)胃管灌服地塞米松。第3天，兩組中每只小白鼠灌胃接種人源隱孢子蟲(chóng)，每只小白鼠感染量為1.5×106個(gè)卵囊。結(jié)果：兩組均在感染的當(dāng)天就有卵囊排出，感染后第6天糞便卵囊計(jì)數(shù)明顯增加，隨之出現(xiàn)3個(gè)高峰期，此后逐漸下降。免疫抑制組小白鼠在卵囊持續(xù)期不斷有死亡但無(wú)腹瀉癥狀。結(jié)論：用這兩種免疫抑制方法，均能成功感染人源隱孢子蟲(chóng)，但通過(guò)灌服地塞米松可使小白鼠獲得更高的OPG(每克糞便中的卵囊數(shù))值和更長(zhǎng)的排卵囊持續(xù)

3、期。 2.為了近一步了解人源隱孢子蟲(chóng)在小白鼠體內(nèi)的內(nèi)生發(fā)育情況。作者采用19日齡昆明系小白鼠作為模型動(dòng)物，隨機(jī)分成8組，分3個(gè)感染劑量進(jìn)行人源隱孢子蟲(chóng)分離株感染系列篩選試驗(yàn)，并確定隨劑量和時(shí)間不同對(duì)人源隱孢子蟲(chóng)在小白鼠寄生部位的影響。感染后于4H、8H、12H、48H、72H破殺高劑量組。4D、6D、9D、12D，16D，20D破殺中劑量組。取每只小白鼠的消化道和其他臟器用福爾馬林固定，作組織切片觀察人源隱孢子蟲(chóng)在小白鼠體內(nèi)的寄

4、生部位和內(nèi)生發(fā)育情況。結(jié)果表明隱孢子蟲(chóng)主要寄生在小白鼠十二指腸、空腸和回腸。在感染早期主要寄生在空腸和回腸，在感染中后期主要寄生在十二指腸和空腸。 3.為了從分子上了解本試驗(yàn)室所分離到隱孢子蟲(chóng)株所屬的種或基因型，作者對(duì)所分離到隱孢子蟲(chóng)種株進(jìn)行PCR擴(kuò)增18SrRNA基因全序列和HSP70基因序列，并對(duì)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，然后利用ClustalX、DNAstar和Paup等軟件對(duì)其進(jìn)行序列分析比較、構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)，試圖從分子上

5、證明河南省不同地區(qū)不同種類隱孢子蟲(chóng)的遺傳特征，以闡明隱孢子蟲(chóng)病的分子流行病學(xué)特點(diǎn)。通過(guò)18SrRNA基因全序列和HSP70序列分析，河南人源隱孢子蟲(chóng)分離株為小球隱孢子蟲(chóng)鼠基因型；河南鹿源隱孢子蟲(chóng)分離株不同與小球隱孢子蟲(chóng)鹿基因型；河南豬源隱孢子蟲(chóng)的兩個(gè)分離株均為小球隱孢子蟲(chóng)豬基因型，即豬隱孢子蟲(chóng)；河南鵪鶉源的隱孢子蟲(chóng)兩個(gè)分離株分別為貝氏隱孢子蟲(chóng)和火雞隱孢子蟲(chóng)；河南烏雞隱孢子蟲(chóng)和鴕鳥(niǎo)隱孢子蟲(chóng)分離株均為貝氏隱孢子蟲(chóng)；河南牛源隱孢子蟲(chóng)分離株為安

6、氏隱孢子蟲(chóng)。 4.本試驗(yàn)以核編碼的線粒體功能性蛋白基因Cpn60，AOX和PNO作為研究對(duì)象，對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離到隱孢子蟲(chóng)分離株進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，以確定在動(dòng)物源隱孢子蟲(chóng)線粒體相關(guān)基因是否存在，對(duì)擴(kuò)增出的序列進(jìn)行比對(duì)分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，以確定不同隱孢子蟲(chóng)株之間的進(jìn)化關(guān)系，并與18SrRNA基因和HSP70基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)作對(duì)照，進(jìn)而評(píng)價(jià)這些基因是否更適合作為隱孢子蟲(chóng)分類和進(jìn)化關(guān)系的基因座。結(jié)果通過(guò)CPN60、AOX和PNO基因編碼序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)