葡萄采后灰霉病生防酵母菌作用機理及其生防效力改良.pdf

1、灰霉病(Botrytis cinerea)是葡萄采后病害中最具毀滅性的病害之一。長期以來,SO2熏蒸等被認為是最有效的防治措施。隨著人們對于農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染以及人類健康等方面的不斷關(guān)注,迫切需要新型高效、環(huán)保、無毒的生物保鮮劑來取而代之。
　　 本研究旨在分離、篩選能有效抑制葡萄采后灰霉病的生防酵母菌株,建立該菌株的作用模式,并通過添加外源物質(zhì)進一步提高其生防能力。通過對該酵母菌株作用機理進行研究,建立包括營養(yǎng)空間競爭、寄生、

2、誘導(dǎo)抗性及產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等在內(nèi)的綜合抑菌機理模式。主要結(jié)果如下:
　　 1.從葡萄果實及果實傷口處共分離到酵母菌株248株。通過離體篩選得到10個菌株對灰霉病有明顯的拮抗作用。其中,濃度為1.0×108個/mL的菌株P(guān)-2對1.0×105spore/mL灰霉菌的抑菌圈可達到23.08 mm。進一步活體篩選得到可顯著抑制葡萄灰霉病的生防菌P-2。果實接種處理6 d后,1.0×108個/mL菌株P(guān)-2可完全抑制果實發(fā)病。
　　

3、 葡萄果實貯藏實驗結(jié)果:貯藏50 d后,生防菌P-2處理后果實的發(fā)病率為15％,與多菌靈處理后的果實發(fā)病率(14％)無顯著差異。此外,生防菌P-2可在一定程度上降低葡萄貯期內(nèi)的果實脫粒率。貯藏50 d后,生防菌P-2處理后的葡萄果實脫粒率為28％,與對照處理(40％)差異顯著。
　　 生防菌P-2處理對葡萄果實的可溶性固形物含量、可滴定酸和Vc含量無顯著影響,不影響果實品質(zhì)。
　　 2.生防菌P-2對于葡萄采后灰霉菌的最

4、佳作用模式:與培養(yǎng)原液、無菌濾液相比,菌株P(guān)-2細胞懸浮液對于灰霉菌的生防效果最佳,抑病率可達到90％。菌株P(guān)-2供試濃度為1.0×108個/mL時生防效力最佳,可以完全抑制1.0×104 spores/mL、1.0×105 spores/mL和1.0×106 spores/mL灰霉菌生長；先接種菌株P(guān)-2后接種灰霉菌處理的生防效力最佳,與生防菌和病原菌同時接種相比,接種菌株P(guān)-2后2 h,24 h和48 h再接種灰霉菌的果實發(fā)病率明顯

5、降低。
　　 3.拮抗酵母菌鑒定:經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化指標及rDNA-ITS序列分析對菌株P(guān)-2進行了鑒定。結(jié)果表明:菌株P(guān)-2為漢遜酵母屬(Hanseniaspora)葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)。
　　 4.通過對H.uvarum P-2拮抗機理進行初步探討,發(fā)現(xiàn)其可能存在的作用機理如下:
　　 (1)顯著抑制灰霉菌孢子萌發(fā)和菌絲生長。生防菌P-2對于灰霉孢子萌發(fā)及菌絲生長的抑

6、制率分別達到88％和70％。
　　 (2)可在葡萄果實傷口處迅速定殖生長,與灰霉菌間形成強有力的競爭作用。在灰霉菌存在或者不存在的情況下,生防菌P-2均可在果實傷口處迅速定殖和生長。營養(yǎng)空間競爭可能是生防菌P-2的抑菌機理之一。
　　 (3)在常溫貯藏條件下,生防菌P-2處理能夠顯著提高果實過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸裂解酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及β-1,3-葡

7、聚糖酶等抗病性相關(guān)酶活性,因此推測誘導(dǎo)抗性可能是H.uvarum P-2的抑菌機理之一。
　　 (4)通過顯微鏡觀察,可發(fā)現(xiàn)生防菌P-2能緊密吸附在灰霉菌菌絲體上,推測菌株P(guān)-2與灰霉菌之間可能存在寄生關(guān)系。
　　 (5)從菌株P(guān)-2無菌發(fā)酵液中分離到抑菌物質(zhì)粗提物。其生理生化性質(zhì)研究結(jié)果表明:粗提物對葡萄、芒果和柑橘主要采后病害表現(xiàn)強抑制作用；經(jīng)121℃高溫高壓處理20 min、蛋白酶K、胰蛋白酶處理,均不能破壞其抑菌

8、活性；且該粗提物呈酸性。
　　 優(yōu)化該抑菌物質(zhì)粗提物發(fā)酵條件,結(jié)果表明:在自然pH值條件下,接種量為1％,搖瓶裝液量為50 ml/250 ml,培養(yǎng)36 h～48 h時,抑菌物質(zhì)產(chǎn)量較大。
　　 5.生防菌P-2生防效力改良實驗結(jié)果表明:鉬酸銨(NH4-Mo)、硅酸鈉(Na2SiO3)、碳酸氫鈉(NaHCO3)和茶多酚(tea polyphenol)等物質(zhì)均在一定濃度下顯著提高生防菌P-2抑菌能力。氯化鈣(CaCl2)不