microRNA-21對(duì)豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、在飼養(yǎng)條件一致前提下，豬產(chǎn)肉量的高低和肉品質(zhì)主要取決于肌纖維的數(shù)量和橫截面積，而豬的肌纖維數(shù)量在胚胎期間就已經(jīng)固定，所以胚胎間骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育成為豬產(chǎn)肉數(shù)量和性狀的一個(gè)重要因素。而骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育是個(gè)很復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，受到多種因素的調(diào)控，研究表明microRNA（miRNA）對(duì)其發(fā)揮重要調(diào)控作用。microRNA是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼的小分子，其長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，對(duì)生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老

2、和死亡等生物學(xué)過(guò)程都有著重要的作用。本課題組通過(guò)高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-21在豬胚胎骨骼肌發(fā)育過(guò)程中有差異表達(dá)，且在特定階段存在豐富表達(dá)。鑒于miR-21在醫(yī)學(xué)疾病中的重要作用意義和本課題的新發(fā)現(xiàn)，我們開(kāi)展miR-21對(duì)豬骨骼肌發(fā)育調(diào)控的研究，旨在為后期豬骨骼肌發(fā)育調(diào)控機(jī)理和豬的遺傳育種相關(guān)研究提供參考信息。
　　 microRNA通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)而廣泛參與體內(nèi)眾多生理和疾病過(guò)程，miR-21調(diào)控骨骼肌的發(fā)育也是同樣的機(jī)理。我

3、們運(yùn)用生物信息學(xué)檢索比較分析，確定候選靶基因TGFBI，設(shè)計(jì)引物，合成miR-21 minics，克隆獲得豬TGFBI基因的部分3'UTR，構(gòu)建Psi-Check2-TGFBI3'UTR載體，轉(zhuǎn)染PIEC和PK15細(xì)胞，檢測(cè)螢光素酶活性。同時(shí)利用熒光定量PCR和Western blot等試驗(yàn)驗(yàn)-miR-21在RNA和蛋白水平上的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21 minics組熒光素酶活性低于對(duì)照組，miR-21在RNA水平上抑制TGFBI

4、基因的表達(dá)，但差異不顯著（P＞0.05），同時(shí)在蛋白水平也發(fā)生了抑制現(xiàn)象，差異顯著(P＜0.05)。
　　 同時(shí)利用熒光定量PCR，檢測(cè)了miR-21及其候選靶基因TGFBI在通城豬和長(zhǎng)白豬中的組織表達(dá)譜，以及出生前后骨骼肌發(fā)育中（28個(gè)發(fā)育階段）的表達(dá)變化，結(jié)果顯示miR-21在通城豬和長(zhǎng)白豬中時(shí)空表達(dá)譜有差異，組織表達(dá)分析顯示，miR-21在成年通城母豬的卵巢中表達(dá)最豐富，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織(P＜0.05)。在成年長(zhǎng)白母豬中，

5、miR-21在肝臟組織中表達(dá)顯著高于其他組織（P＜0.05），其他組織中分布相對(duì)平衡，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)組織;通城豬與長(zhǎng)白豬相比較發(fā)現(xiàn)，miR-21在通城豬和長(zhǎng)白豬同一個(gè)組織表達(dá)存在差異。在心、肝、肺、腎、小腸、子宮和背最長(zhǎng)肌中長(zhǎng)白豬miR-21的表達(dá)量顯著高于通城豬（P＜0.05），其他組織（脾、卵巢）差異不顯著。時(shí)期表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-21在脂肪型通城豬和瘦肉型長(zhǎng)白豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)模式存在明顯差異，通城豬從胚胎期33

6、d到成年，miR-21都有不同程度的表達(dá)，在胚胎期90d達(dá)到峰值。長(zhǎng)白豬中，出生前的E33 d幾乎檢測(cè)不到表達(dá)而胚胎期105 d是最高表達(dá)豐度，其他階段之間miR-21表達(dá)變化不大，成年背最長(zhǎng)肌中相對(duì)較低。miR-21的表達(dá)在胚胎期55 d，80 d、90 d和95 d，通城豬和長(zhǎng)白豬存在顯著差異。在mRNA水平，候選靶基因TGFBI在成年通城豬和長(zhǎng)白豬組織表達(dá)譜相對(duì)一致，TGFBI在脾臟中含量最豐富，顯著高于其他組織(P＜0.05)，

7、其次肺中也有較高的表達(dá)，成年背最長(zhǎng)肌中TGFBI水平最低，心肌中表達(dá)也很低。其他組織（肝、小腸、子宮和腎）也檢測(cè)到TGFBI有較低的表達(dá)。通城和長(zhǎng)白豬整個(gè)發(fā)育期的骨骼肌中基本都檢測(cè)出TGFBI的表達(dá)。胚胎期33 d至胚胎期50 d表達(dá)量成上升趨勢(shì)，胚胎期50 d達(dá)到峰值，隨著骨骼肌的發(fā)育，TGFBI含量也逐漸減少，成年骨骼肌中幾乎檢測(cè)不到TGFBI的存在。胚胎期55d、100d和出生后9d、180 d和成年豬中，TGFBI表達(dá)存在顯著差