兩種植物呼腸孤病毒的小管蛋白鑒定及其功能結(jié)構(gòu)域研究.pdf

1、近幾年,由水稻呼腸孤病毒引起的水稻病害普遍流行,其中水稻南方黑條矮縮病和水稻鋸齒葉矮縮病是爆發(fā)最嚴(yán)重的病害,給我國(guó)的水稻生產(chǎn)帶來(lái)了巨大的損失。這兩種病害的病原體分別為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern riceblack-streaked dwarf virus,SRBSDV)和水稻鋸齒葉矮縮病毒(Rice ragged stuntvirus,RRSV)。目前,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了SRBSDV和RRSV的發(fā)生及危害、病害癥狀、品種抗性及

2、流行因?yàn)椤㈩A(yù)測(cè)及防治、寄主和傳播介體、病原及病原血清學(xué)、分類地位、基因組結(jié)構(gòu)與功能、與寄主和介體間的互作關(guān)系等方面,但對(duì)于病毒如何侵染寄主、在寄主體內(nèi)如何復(fù)制增殖和傳播擴(kuò)散機(jī)制等尚不清楚。因此從蛋白功能研究病毒的侵染運(yùn)輸通道對(duì)防控病害的發(fā)生有十分重要的作用。
　　 通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7兩個(gè)基因序列,分別將其構(gòu)建到桿狀病毒真核表達(dá)載體pDEST8上,通過(guò)篩選鑒定獲得目的載體重組子pDEST8

3、-SRBSDV-P7-1和pDEST8-RRSV-P7。再將它們轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac中重組產(chǎn)生桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中所需的重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SRBSDV-P7-1和Bacmid-RRSV-P7。Bacmid質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中,使SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在細(xì)胞中表達(dá)。通過(guò)免疫熒光觀察目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況、Western blot檢測(cè)目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)和電鏡觀察目的蛋白的結(jié)構(gòu)形態(tài)。結(jié)果表明,SRBS

4、DV-P7-1和RRSV-P7在sf9細(xì)胞中都得到了正確表達(dá),且它們?cè)诩?xì)胞中都形成小管狀結(jié)構(gòu),小管呈網(wǎng)狀分布,能伸出細(xì)胞膜延長(zhǎng)至相鄰細(xì)胞；電鏡觀察提純的小管狀蛋白直徑約85nm,呈圓筒狀內(nèi)部中空,分布于細(xì)胞中。這說(shuō)明了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7即為兩種病毒中的小管蛋白。
　　 為了進(jìn)一步了解小管蛋白的主要功能結(jié)構(gòu)域,生物信息學(xué)分析了兩個(gè)蛋白的結(jié)構(gòu),預(yù)測(cè)其跨膜區(qū)。利用缺失突變體方法研究跨膜區(qū)和末端保守區(qū)對(duì)小管形成和功能

5、的影響,分別構(gòu)建了缺失SRBSDV-P7-1和RRSV-P7的跨膜區(qū)和N端、C端蛋白序列的突變體,獲得了重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-P7-1-ΔTM1、Bacmid-P7-1-ΔTM2、Bacmid-P7-1-ΔTM3、Bacmid-P7-1-ΔN、Bacmid-P7-1-ΔC和Bacmid-P7-ΔTM、Bacmid-P7-ΔN、Bacmid-P7-ΔC,轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞使之表達(dá),免疫熒光處理表達(dá)細(xì)胞后共聚焦顯微鏡觀察缺失突變體表達(dá)情況。

6、結(jié)果表明,SRBSDV-P7-1和RRSV-P7缺失跨膜區(qū)和末端序列后在細(xì)胞中均不再形成管狀結(jié)構(gòu),說(shuō)明跨膜區(qū)和末端保守區(qū)都參與小管蛋白的形成,對(duì)小管功能的發(fā)揮起著十分重要的作用。
　　 綜上所述,通過(guò)Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7兩個(gè)預(yù)測(cè)的小管蛋白及其它們的缺失突變體；利用’Western blot檢測(cè)了蛋白表達(dá):利用免疫熒光方法處理表達(dá)細(xì)胞后共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達(dá)情況；利