兩種植物呼腸孤病毒的小管蛋白鑒定及其功能結構域研究.pdf

1、近幾年,由水稻呼腸孤病毒引起的水稻病害普遍流行,其中水稻南方黑條矮縮病和水稻鋸齒葉矮縮病是爆發(fā)最嚴重的病害,給我國的水稻生產(chǎn)帶來了巨大的損失。這兩種病害的病原體分別為南方水稻黑條矮縮病毒(Southern riceblack-streaked dwarf virus,SRBSDV)和水稻鋸齒葉矮縮病毒(Rice ragged stuntvirus,RRSV)。目前,國內外學者研究了SRBSDV和RRSV的發(fā)生及危害、病害癥狀、品種抗性及

2、流行因為、預測及防治、寄主和傳播介體、病原及病原血清學、分類地位、基因組結構與功能、與寄主和介體間的互作關系等方面,但對于病毒如何侵染寄主、在寄主體內如何復制增殖和傳播擴散機制等尚不清楚。因此從蛋白功能研究病毒的侵染運輸通道對防控病害的發(fā)生有十分重要的作用。
　　 通過RT-PCR擴增了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7兩個基因序列,分別將其構建到桿狀病毒真核表達載體pDEST8上,通過篩選鑒定獲得目的載體重組子pDEST8

3、-SRBSDV-P7-1和pDEST8-RRSV-P7。再將它們轉化大腸桿菌DH10Bac中重組產(chǎn)生桿狀病毒表達系統(tǒng)中所需的重組穿梭質粒Bacmid-SRBSDV-P7-1和Bacmid-RRSV-P7。Bacmid質粒轉染至sf9昆蟲細胞中,使SRBSDV-P7-1和RRSV-P7在細胞中表達。通過免疫熒光觀察目的基因在細胞中的表達情況、Western blot檢測目的基因在細胞中的表達和電鏡觀察目的蛋白的結構形態(tài)。結果表明,SRBS

4、DV-P7-1和RRSV-P7在sf9細胞中都得到了正確表達,且它們在細胞中都形成小管狀結構,小管呈網(wǎng)狀分布,能伸出細胞膜延長至相鄰細胞；電鏡觀察提純的小管狀蛋白直徑約85nm,呈圓筒狀內部中空,分布于細胞中。這說明了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7即為兩種病毒中的小管蛋白。
　　 為了進一步了解小管蛋白的主要功能結構域,生物信息學分析了兩個蛋白的結構,預測其跨膜區(qū)。利用缺失突變體方法研究跨膜區(qū)和末端保守區(qū)對小管形成和功能

5、的影響,分別構建了缺失SRBSDV-P7-1和RRSV-P7的跨膜區(qū)和N端、C端蛋白序列的突變體,獲得了重組穿梭質粒Bacmid-P7-1-ΔTM1、Bacmid-P7-1-ΔTM2、Bacmid-P7-1-ΔTM3、Bacmid-P7-1-ΔN、Bacmid-P7-1-ΔC和Bacmid-P7-ΔTM、Bacmid-P7-ΔN、Bacmid-P7-ΔC,轉染sf9細胞使之表達,免疫熒光處理表達細胞后共聚焦顯微鏡觀察缺失突變體表達情況。

6、結果表明,SRBSDV-P7-1和RRSV-P7缺失跨膜區(qū)和末端序列后在細胞中均不再形成管狀結構,說明跨膜區(qū)和末端保守區(qū)都參與小管蛋白的形成,對小管功能的發(fā)揮起著十分重要的作用。
　　 綜上所述,通過Bac-to-Bac桿狀病毒真核表達系統(tǒng)表達了SRBSDV-P7-1和RRSV-P7兩個預測的小管蛋白及其它們的缺失突變體；利用’Western blot檢測了蛋白表達:利用免疫熒光方法處理表達細胞后共聚焦顯微鏡觀察蛋白表達情況；利