水貂呼腸孤病毒分離鑒定及反向遺傳初步研究.pdf

1、20世紀(jì)50年代呼腸孤病毒的發(fā)現(xiàn)，首次證實(shí)了雙鏈RNA病毒可作為穩(wěn)定的生命形式存在于自然界，由于主要從呼吸道或腸道中分離出此病毒，并且當(dāng)時(shí)對(duì)它的致病作用不清楚，所以稱它為呼吸道、腸道、孤兒病毒，簡(jiǎn)稱呼腸孤病毒（Reovirus）。
　　哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒（Mammalian Orthoreovirus，MRV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridea）正呼腸孤病毒屬（Orthoreovirus）成員，病毒粒子無(wú)囊膜，二十面體對(duì)稱，

2、具有雙層衣殼。基因組由10條雙鏈RNA組成，分為3個(gè)大片段（L1～L3）、3個(gè)中片段（M1～M3）以及4個(gè)小片段（S1～S4），共編碼8種結(jié)構(gòu)蛋白和3種非結(jié)構(gòu)蛋白。MRV有4個(gè)主要的血清型，其代表株為血清1型Lang（T1L）、血清2型Jones（T2J）、血清3型Dearing（T3D）以及血清4型Ndelle（T4N）。
　　目前有關(guān)水貂呼腸孤病毒的報(bào)道較少，1975年德國(guó)研究人員首次從水貂中分離到一株呼腸孤病毒，1992年劉

3、維全等在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了一株從水貂中分離的呼腸孤病毒，2011年連海等首次從水貂中分離到一株血清1型呼腸孤病毒HB-A株。雖然大多數(shù)呼腸孤病毒感染并沒(méi)有明顯癥狀或癥狀較輕，但是該病毒可能與其他病毒混合感染從而加重病情，造成水貂生長(zhǎng)遲緩、被毛粗亂，嚴(yán)重影響貂皮的質(zhì)量，從而給養(yǎng)殖業(yè)造成損失。
　　反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，極大推動(dòng)了病毒學(xué)發(fā)展。與經(jīng)典的從表型改變到進(jìn)行基因功能研究的思路相反，反向遺傳技術(shù)是指通過(guò)構(gòu)

4、建RNA病毒的感染性克隆，在病毒cDNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行人工體外操作，如進(jìn)行基因突變、缺失、插入、置換等改造，從而研究RNA病毒的基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控機(jī)制、病毒和宿主細(xì)胞的相互作用關(guān)系、抗病毒策略和基因治療，以及構(gòu)建新型病毒載體來(lái)表達(dá)外源基因和進(jìn)行新疫苗研制等，因此對(duì)RNA病毒進(jìn)行遺傳拯救已成為分子病毒學(xué)研究的必經(jīng)之路。然而，呼腸孤病毒基因組的復(fù)雜性妨礙了其反向遺傳系統(tǒng)的建立，也制約了病毒各方面的研究。
　　2014年山東某貂廠發(fā)

5、生以腹瀉癥狀為主的疾病，取腸道內(nèi)容物接種于BHK-21和Vero細(xì)胞，經(jīng)盲傳，細(xì)胞出現(xiàn)了變圓、脫落等病變。經(jīng)電鏡觀察，觀察到無(wú)囊膜、二十面體對(duì)稱、雙層衣殼和直徑約75nm的病毒粒子。RT-PCR和BLAST結(jié)果表明，病毒粒子為哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒，命名為MRV3 SD-14株。測(cè)定了SD-14株的病毒滴度、血凝性以及致病性，SD-14株在BHK-21和Vero 細(xì)胞上的TCID50為105.625 TCID50/mL和105

6、TCID50/mL；SD-14株在4℃、室溫以及37℃條件下，對(duì)人O型血紅細(xì)胞以及雞、豚鼠、牛和兔的紅細(xì)胞均不發(fā)生凝集反應(yīng)；將SD-14株經(jīng)口和腦內(nèi)接種乳鼠，對(duì)乳鼠不致病，對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。設(shè)計(jì)特異引物，經(jīng)RT-PCR獲得了SD-14株全基因組序列，并將序列提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，登錄號(hào)為KT224504-KT224513。序列分析結(jié)果表明，SD-14株為血清3型呼腸孤病毒，其L1、L3、M3和S3與人源MRV2Tou05株有

7、較高相似度，分別為97.40％，96.92%，97.09%和97.20%；S2與T1L標(biāo)準(zhǔn)株有較高相似度，為96.17%；L2、M2及S1與豬源的GD-1株有較高相似度，分別為97.39%、98.37%和98.66%；M1和S4與豬源的SC-A株有較高相似度，分別為95.53%和97.58%。此外，SD-14株與貂源的HB-A株具有高度的序列相似性。綜合序列的相似性以及根據(jù)每個(gè)片段所構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)，推測(cè)SD-14株為人源、豬源以及貂源呼腸

8、孤病毒混合感染產(chǎn)生的新的重組病毒。此外，序列分析顯示，SD-14株的S1片段第246個(gè)密碼子為終止密碼子，可能造成σ1蛋白翻譯提前終止，從而對(duì)病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響。SD-14株是首次從水貂中分離獲得的血清3型呼腸孤病毒，SD-14株的分離豐富了水貂呼腸孤病毒的基因庫(kù)以及生物特性，對(duì)于研究呼腸孤病毒在水貂群中的流行、進(jìn)化等具有重要意義。
　　為了解呼腸孤病毒在水貂群中的感染情況，本實(shí)驗(yàn)采用微量中和試驗(yàn)調(diào)查了山東、河北以及吉林水貂

9、群中呼腸孤病毒的血清抗體水平，以期從抗體水平了解呼腸孤病毒感染的流行狀況。結(jié)果表明，血清陽(yáng)性率分別為：山東92.5%，河北82.1%，吉林91.7%，表明該病毒在上述地區(qū)水貂群中具有較高水平的感染率。
　　建立呼腸孤病毒反向遺傳操作平臺(tái)，是深入研究該病毒的蛋白功能以及致病機(jī)制的關(guān)鍵途徑。本研究首先對(duì)呼腸孤病毒HB-A株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，以確定病毒真實(shí)的cDNA序列，為下一步構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA克隆提供參考。通過(guò)RT-PCR獲得呼腸孤

10、病毒HB-A株全基因組10個(gè)片段，將其分別插入含T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子、丁肝病毒核酶以及T7 RNA聚合酶終止子的表達(dá)盒中，獲得10個(gè)重組質(zhì)粒pcDNA-T7-L1、pcDNA-T7-L2、pcDNA-T7-L3、pcDNA-T7-M1、pcDNA-T7-M2、pcDNA-T7-M3、pcDNA-T7-S1、pcDNA-T7-S2、pcDNA-T7-S3和pcDNA-T7-S4，同時(shí)將L1片段2193位的T突變?yōu)镃，作為分子標(biāo)記，以區(qū)

11、分野毒和重組毒。此外，將σ1s蛋白的起始密碼子由ATG突變?yōu)锳CG，使σ1s蛋白不表達(dá)，為構(gòu)建σ1s蛋白缺失突變型呼腸孤病毒做準(zhǔn)備。將10個(gè)重組質(zhì)粒按照合適的配比濃度共轉(zhuǎn)染BHK-T7細(xì)胞系，37℃培養(yǎng)3～5d，收獲細(xì)胞并反復(fù)凍融3次，在BHK-21細(xì)胞上進(jìn)行傳代。
　　本研究首次分離到一株貂源血清3型呼腸孤病毒MRV3 SD-14株，并對(duì)其增殖、感染和血凝等生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定；對(duì)山東、河北、吉林等地水貂群的呼腸孤病毒感染率進(jìn)行